2 胚胎干细胞的定向诱导一般都通过拟胚体途径，请问与不经过拟胚体途径直接诱导有什么区别？
3 胚胎干细胞在没有LIF时很快分化，从实验中看这些细胞分化后很快死亡，不知这些分化后的细胞都是些什么细胞，为何如此短命？
4 看文献上的胚胎干细胞 定向诱导分化，都是多少天到多少天加某个细胞因子，是不是有点玄乎？如何知道细胞的分化到这天就需要这个细胞因子，而过了这一天就不需要了？
谢谢！
我对楼主的第2,3,4问题发表个人理解:
2. 胚胎干细胞(为方便, 下简称ES) 定向分化研究的经典途径是: 扩增ES后, 撤去LIF, 继续悬浮或悬滴培养2--5天, 形成拟胚体(E B ), 然后用不同的措施定向诱导分化为目的细胞. 之所以经EB途径, 目的是模拟体内胚胎发育过程, EB中内中外三胚层的细胞互相支持, 互相提供分化生长的微环境. 近3年来, 陆续有文章报道不经EB途径, 直接诱导ES分化亦可获得目的细胞, 同时指出EB的空间立体结构使分化所得细胞含有大量不同分化时期细胞, 有悖高效性原则. 但目前主流还是使用经典途径, 包括06年在Nat.发表的几篇有关ES定向分化文章.
3. 经EB途径得到的细胞"短命"原因, 与细胞接触抑制有关, 也与因空间受限不能良好的吸收培养基营养有关.
4. 目前ES定向分化研究极不成熟, 程序性添加诱导因子的依据是, 在胚胎中这些因子是程序性表达的, 如向肝脏分化先表达FGF,然后表达HGF, 体外实验就先添加FGF,然后添加HGF, 其目的是模拟体内胚胎发育过程.
1 胚胎干细胞为何呈克隆性生长，而不是铺开生长？这是由胚胎干细胞的什么特征决定的？
这个问题没想出来，不知是否与其来源（内细胞团）有关，细胞连接？
2 胚胎干细胞的定向诱导一般都通过拟胚体途径，请问与不经过拟胚体途径直接诱导有什么区别？
两种方法的目的都是一样的，呵呵，那就是拿到纯度高，活性好，数量多的目的细胞。
拟胚体途径是经典途径，拿到目的细胞的机会很大，但纯度不会太高，在首次定性试验中建议使用这种方法。直接分化是一个尝试性的工作，得到的细胞纯度大，但功能和活性往往有一定的问题。
3 胚胎干细胞在没有LIF时很快分化，从实验中看这些细胞分化后很快死亡，不知这些分化后的细胞都是些什么细胞，为何如此短命？
自己认为是细胞进行了选择，也就是说不符合条件（筛选培养液）的细胞多数死亡（主要根据丁酸钠诱导ES细胞分化的试验）。当然，LIF是否起到了抑制凋亡的作用我没查文献，有可能。
4 看文献上的胚胎干细胞 定向诱导分化，都是多少天到多少天加某个细胞因子，是不是有点玄乎？如何知道细胞的分化到这天就需要这个细胞因子，而过了这一天就不需要了？
就像scalpel3所述，这个也是摸索出来的，因为拟胚体的分化部分模拟了体内胚胎发育过程，所以对于一些发育机制比较清楚的可以采用不同时间添加不同的细胞因子和细胞外基质的方法进行诱导。
谢谢！
谢谢scalpel3和qjzhou2000 两大高手指点，非常受益！
楼主的问题看起来都是些基础的问题，但是细想起来还真是不是那么好回答。
1.我觉得干细胞石油内细胞团进一步发育而来的，而内细胞团和滋养层的分化可以说是胚胎发育过程中的第一次分化了。因此可以说是有较大的同源性，之间有较大的细胞粘性。所以在成纤维细胞组成的滋养层上相互吸引黏附在一起生长，而且在体内内细胞团开始也是这样生长的，再慢慢的发生分化。
2.同意楼上的观点，解释得很详尽。具体应用何种方法分化视情况而定。例如：ES向精子分化的过程没有经过类胚体的阶段、而向卵母细胞的分化却经过类胚体来完成。
3.LIF作为一个细胞因子起作用非常广泛，既可以参与细胞信号传导抑制干细胞分化、也有刺激干细胞增殖的功能。分化出来的细胞应该说包括三胚层的所有细胞类型，只是我觉得这些细胞并不一定很快死亡，死亡的只是少数，可能与这种细胞类型不适合这种培养环境有关！
4.同意楼上的看法，只是想补充一点，现在所采用的分化方案并不是一蹶而就想出来的，应该是通过很多研究人员经过很长的时间摸索出来的途径。而且可能仍然存在问题，有待改进。
1 胚胎干细胞为何呈克隆性生长，而不是铺开生长？这是由胚胎干细胞的什么特征决定的？
我简单说两句,仅供参考.
这和ES细胞的癌细胞特性有关.ES这种克隆性的增长可以满足细胞生长需要的营养以及细胞之间的通信和交流.这种集落式的生长最后使细胞处于细胞的特定阶段,维持细胞之间特定基因的表达.
呵呵..........
请高手指教
非常稀饭这样的帖子!不是搞es的,也想讲几句,嘿嘿!
我对第一个和第四个问题感兴趣,(不是来回答问题的)
1,这个问题的提出真是太不容易了,佩服楼主的思维!前面两位兄弟的想法很有道理,但我有自己的看法,es细胞算是干细胞里面级别相当高的细胞了吧,只有它才能最后发育成为一个个体,而一个个体的形成最重要的一方面是其三维结构的形成,所以es这种集落样生长的现象就它的一个相当重要特性的表现,也只有具备了这个特性才能促使完整个体的形成,对这种现象的深入认识对于从另一个角度认识发育不是很有趣么?很荣易想到的,这个现象的背后肯定是细胞间通信的原因,单方向的通信肯定完成不了,所以细胞间的交流和反馈我认为是es所独有的;
4.这个问题有点玄乎,可事实就是这样,或许分化调控的过程并非我们所认为的那么复杂,或许就是因为这一两个因子的关键作用在其中发挥着决定性作用
请问胚胎干细胞克隆、拟胚体和已分化的胚胎干细胞细胞团（非拟胚体）如何在形态上予以区分？
有文献提到，胚胎干细胞克隆除去lif后，可以在STO上直接分化为拟胚体。我想知道胚胎干细胞克隆分化到什么程度就是拟胚体了？
这个问题还是我来回答吧，毕竟后者是俺们做的。
典型未分化的小鼠胚胎干细胞克隆成典型的集落状；如果发现细胞团比较扁平或细胞团周围有纤维样细胞，则认为细胞已经开始分化；拟胚体的形态比较好看，圆球形，如果分化方法妥当的话，可以看到分为内外两层，外层为原始内胚层细胞。如果是在STO细胞上形成的拟胚体则早中期呈现半贴壁状态，晚期则呈现悬浮状态。
关于拟胚体的说明，一般认为细胞聚集成团后，首先呈现simple EBs（简单拟胚体）；而后随着外层细胞的分化，内部逐渐出现空腔，则称谓cystic EBs（囊状拟胚体）。
人的细胞没做过，请做过的朋友发言
fangsheng wrote:
请问胚胎干细胞克隆、拟胚体和已分化的胚胎干细胞细胞团（非拟胚体）如何在形态上予以区分？
有文献提到，胚胎干细胞克隆除去lif后，可以在STO上直接分化为拟胚体。我想知道胚胎干细胞克隆分化到什么程度就是拟胚体了？
that is interesting....
STO do secret their own LIF..
so how this can happen?
fangsheng wrote:
4 看文献上的胚胎干细胞 定向诱导分化，都是多少天到多少天加某个细胞因子，是不是有点玄乎？如何知道细胞的分化到这天就需要这个细胞因子，而过了这一天就不需要了？
谢谢！
basically why them emphasis adding cytokin at exactly date is try to remove variable factors , actually the exactly date is not such important.
why they add those cykokines at that day normally because ages ago someone added at it at that day, to replicate the previous one's results,they have to do everything excatly the same way
nanog wrote:
that is interesting....
STO do secret their own LIF..
so how this can happen?
这个确实很有趣，我们也不知道什么原因。形成的EB结构很好，包括形态、切片和电镜都做过。
有兴趣的朋友可以看一下。
文章发表在Cell biology international。
qjzhou2000 wrote:
这个确实很有趣，我们也不知道什么原因。形成的EB结构很好，包括形态、切片和电镜都做过。
有兴趣的朋友可以看一下。
文章发表在Cell biology international。
please give me the full title
does your paper show
1. thoe EBs on STO cells can form parital endoderm cells?
2. did those EBs form cavity? ( I assumed yes)
3. did your STO cells express LIF, or not?
第一个和第二个问题都已解决。最后一个问题是我想用ELISA做的，时间原因没做，在讨论里面做了解释，有可能是丝裂霉素处理时间长了之后，引起了LIF表达的下降。多指教
Generation of Embryoid Bodies from Mouse Embryonic Stem Cells Cultured on STO Feeder Cells
Cell Biol Int. 2005; 29(9): 817-825
hi I have a quick read about your paper.
and as I asked previously,
since A.Smith showed why STO cells can inhibit ES cells differentiation was LIF from STO cells, and he also showed LIF-/- STO cells can not inhibite ES cells differentiation,
so clearly I would like to see the LIF epxression in your STO cells.
I am not sure mitomycin C treatment will affect LIF epxression, but I doubt whether your STO cells express LIF or not.
by the way, our results and results from our co-operators all showed in our STO cells, we do not need LIF to maintained ES cells.
you do not need ELISA, a RT-PCR for LIF is enough.....
I think that is the reason why your result differs from others.
谢谢nanog的指导，实际上我们有段时间也在用STO细胞进行ES细胞的传代。
关于STO细胞是否变化，限于当时条件，我们只进行了相应的抗性筛选，同时也做了原代MEF细胞对EB形成的影响，结果显示，两者都能诱导拟胚体的形成，只不过在MEF细胞层上形成的拟胚体形态不很典型，且得率比较低。
所以，最后，我们总结起来，可能是丝裂霉素处理时间过长，引起LIF表达量降低，从而促进分化，但，我们没有直接的证据，这也是这片文章之所以投到这本杂志（只有1.2）的主要原因。
因为现在我已经离开原来的实验室，老板现在的兴趣也不在这里了，但我会将你的意见转给老板，谢谢。
qjzhou2000 wrote:
同时也做了原代MEF细胞对EB形成的影响，结果显示，两者都能诱导拟胚体的形成，只不过在MEF细胞层上形成的拟胚体形态不很典型，且得率比较低。
well, think about it....the classical way to making embryoid bodies is using ES cells on feeder cells (haning drop ways can not remove all of feeder cells,), so it is not strange that ES cells on MEF cells can form Embryoid bodies, and because they are on "normal" MEF cells, so it is not suprise those embroyid bodies are not "typical"
I guess you can get embryoid bodies formed basemement membranes, but no parital and visceral endoderm cells.
不明白，我说得不典型并不是指缺少什么结构，只是形态不太好看而已。
基底膜上应该不能形成拟胚体，因为你接上的细胞马上就铺展开分化了。就像拟胚体分化成熟后接于collagen上继续分化一样。
我还不知道hanging drop形成的拟胚体包含饲养层细胞，不知nanog有没有参考文献？
（自己的观点）拟胚体的形成有两个限制因素：
1、细胞团有一定的大小，细胞数量一定要够数。
2、一定时间的悬浮培养，这是后期各胚层分化的基础。
qjzhou2000 wrote:
（自己的观点）拟胚体的形成有两个限制因素：
1、细胞团有一定的大小，细胞数量一定要够数。
2、一定时间的悬浮培养，这是后期各胚层分化的基础。
qjzhou2000版主总结的真好，但我在文献中看到，单个ES去除LIF后在琼脂糖凝胶或藻酸钠胶珠上可以形成拟胚体。我感到困惑的是，我的小鼠ES（CCE）在去除LIF后，在这些材料中几乎不增殖，更谈不上分化为拟胚体了。
经过反复思索，我得出的结论是ES细胞类型不一样，所以结果不一样。
nanog wrote:
that is interesting....
STO do secret their own LIF..
so how this can happen?
我记得曾看过一篇文献，有lif存在时ES在悬浮状态时也可以相互聚集形成EB（不好意思，记不清是哪一篇文献了）
因此，我推测ES在STO上形成EB，很可能不仅仅是LIF分泌减少的缘故，更重要的是STO活性状态有关。STO活性状态不佳时，具有抗贴壁功能，使ES成悬浮状态，因此形成EB。
(没有依据，推测一下)
恩，我的是D3系，其他系没做过，关于活性状态的问题，我考虑过，应该是相关因素之一。早期的STO饲养层可以完全支持ES细胞的增殖，细胞团也呈现典型的未分化状态，但后期，有时可以看到部分STO饲养层细胞死亡脱落。至于是否具有抗贴壁功能，我就不知道了。
你看到的有LIF能形成EB，可能是hEG细胞。
fangsheng wrote:
我记得曾看过一篇文献，有lif存在时ES在悬浮状态时也可以相互聚集形成EB（不好意思，记不清是哪一篇文献了）
The regulation of embryonic stem cell differentiation by leukaemia inhibitory factor (LIF) ?
qjzhou2000 wrote:
不明白，我说得不典型并不是指缺少什么结构，只是形态不太好看而已。
基底膜上应该不能形成拟胚体，因为你接上的细胞马上就铺展开分化了。就像拟胚体分化成熟后接于collagen上继续分化一样。
我还不知道hanging drop形成的拟胚体包含饲养层细胞，不知nanog有没有参考文献？
（自己的观点）拟胚体的形成有两个限制因素：
1、细胞团有一定的大小，细胞数量一定要够数。
2、一定时间的悬浮培养，这是后期各胚层分化的基础。
well, basement membranes are quite easy to be observed under microscope and they are the marker of primitive endoderm cells formation in embryoid bodies, that is whyt I mentioned in previous post.
normally before hanging drop way, you will pre-plate to remove feeder cells, but this can not remove all feeder cells.... that is what I mean.
刚才误解了nanog的意思，关于parital and visceral endoderm cells，我们没有检测，我知道visceral endoderm在EB中的检测，请教nanog一下partial endoderm的检测方法？
Schematic diagram illustrating effects of LIF and the BM on development of epiblast and endodermal cells in EBs
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=411 height=557 title="Click to view full o.JPG (411 X 557)" border=0 align=absmiddle>
qjzhou2000 wrote:
刚才误解了nanog的意思，关于parital and visceral endoderm cells，我们没有检测，我知道visceral endoderm在EB中的检测，请教nanog一下partial endoderm的检测方法？
several way,
frist, in EBs, thick BM normally means formation of Reichert's membranes, parital endoderm cells secrets large mount of laminin, so they can form thick BM, which was called Reichert's membranes in vivo.
second, the morphology or parital endoderm cells is distinguished with visceral and primitive endoderm cells.
third. parietal endoderm cell-specific marker, Endo C.
恩，这个倒值得深入做做，看看与传统的方法形成的拟胚体有什么区别，谢谢nanog和fangsheng两位战友的深入讨论。
fangsheng wrote:
有文献提到，胚胎干细胞克隆除去lif后，可以在STO上直接分化为拟胚体。我想知道胚胎干细胞克隆分化到什么程度就是拟胚体了？
我想请问以下STO不是可以作为饲养层支持ES的生长的吗?怎么还能支持形成EB呢?
看到上面站友的讨论问以下STO的活性与什么相关?如果培养条件合适的话会不会随着代数的增高而使STO的分泌lif能力下降?
现在我使用SNL作为饲养层,不知能否支持ES长期的自我更新呢?
sendohyozen wrote:
我想请问以下STO不是可以作为饲养层支持ES的生长的吗?怎么还能支持形成EB呢?
看到上面站友的讨论问以下STO的活性与什么相关?如果培养条件合适的话会不会随着代数的增高而使STO的分泌lif能力下降?
现在我使用SNL作为饲养层,不知能否支持ES长期的自我更新呢?
read shen's paper in 1992
Leukemia inhibitory factor is expressed by the preimplantation uterus and selectively blocks primitive ectoderm formation in vitro
请问qjzhou2000版主，壁内胚层（parital endoderm cells）和脏内胚层（ visceral endoderm cells）能否分化为肝细胞？二者在正常胚胎发育中是否存在？最终分别发育为什么组织？
对这个问题我也一直模糊不清，直到快毕业，记得有一篇文章专门论述了visceral endoderm cells and definitive endoderm cells来源的“肝细胞”的区别，如果没记错的话，两者只有CYP450表达上的差异。
下面的帖子是我毕业论文综述中的一部分，也请各位发育学专业人士给予指教。
三 拟胚体内胚层分化发育机制
在小鼠胚胎发生发育过程中，囊胚期的内细胞团在E4.5天时分化成具有原始内胚层（primitive endoderm）和原始外胚层(primitive ectoderm)的结构，原始内胚层进一步分化形成脏壁内胚层（visceral endoderm）和腔壁内胚层（parietal endoderm）进而形成胚外卵黄囊（extraembryonic yolk sac），卵黄囊同样包含有来源于外胚层（epiblast）的中胚层细胞。脏壁内胚层可以表达许多与肝细胞相似的基因，例如甲胎蛋白（alpha-fetoprotein)、白蛋白（albumin）、甲状腺素运送蛋白（transthyretin）等。值得注意的是，脏壁内胚层虽然能够参与形成胚外卵黄囊结构，但并不能分化发育成肝脏或胰脏等实质性器官。原始外胚层在E6.5天时通过原肠胚的发育过程分化形成外胚层、中胚层和内胚层。这种定型内胚层（definitive endoderm）沿中线移行至脏壁内胚层中，在小鼠胚胎E7.5天发育形成内胚层肠管（endodermal gut tube）的结构，最后腹侧前肠区域的细胞在心源中胚层、横膈间充质以及内皮细胞三类信号的诱导条件下发育形成肝脏和胰脏。虽然脏壁内胚层和原始内胚层的终末分化完全不同，但它们在分化早期十分相似，因此目前只有少数几个已知的分子标志可以用于区分两种内胚层[7-13]。拟胚体（embryoid body，EB）是胚胎干细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体结构，早期发育的简单拟胚体包含了外层的原始内胚层（primitive endoderm）和内层的原始外胚层（primitive ectoderm），这种结构与胚胎发育过程中的卵圆柱期（egg cylinder stage）结构十分相似。虽然早期的脏壁内胚层与定型内胚层有许多相似的分子特征，但在小鼠胚胎中可以通过不同的位置加以区分，而在拟胚体中却很难将两者区分开。Asahina et al通过对卵黄囊与拟胚体基因表达的分析发现，细胞色素P4507A1（Cyp7a1）只能在肝脏样品中检测到，而在卵黄囊中未见表达，从而确定为肝脏区别于卵黄囊的特异基因。而后作者通过表达有Cyp7a1增强子/启动子调控的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）的ES细胞对肝脏方向的分化进行了研究，结果发现培养的拟胚体中包含有GFP+的上皮样细胞，由此表明，ES细胞可以通过定型内胚层分化形成成熟的肝细胞[13]。 Kubo et al[14]发现,在减少血清刺激或在无血清条件下添加activin A均可以诱导小鼠ES细胞向定型内胚层的分化，将得到的分化细胞移植到受体小鼠的肾包膜后发现可以形成骨骼肌、肠、骨等结构（但未得到肝细胞结构，因为在肾脏中缺少合适的分化环境）。2005年，D'Amour et al采用人ES细胞的研究发现，在低浓度血清以及存在activin A的条件下，hES可以产生超过80％的定型内胚层细胞，进一步利用细胞表面受体CXCR4可以将这部分细胞纯化至均一类型的内胚层细胞。此外，在由hES细胞向定型内胚层分化的过程中，可以观察到明显的上皮-间质转化现象，这个过程与哺乳动物胚胎发育在原肠胚时期的现象相似[15]。拟胚体三个胚层的形成与分化基本模拟了体内胚胎早期发育中组织细胞分化的过程，可以作为研究哺乳动物胚胎发育尤其是早期谱系决定、胚层相互诱导等现象的理想体外模型[16]。Li et al[17]和Esner et al[18]用FGFR2（FGF recepter2）和FGFR1（FGF recepter1）突变干细胞进行研究发现，两种细胞形成的拟胚体都未出现内胚层和基膜等典型结构，由此表明 FGF/FGFR信号转导通路可能在内胚层的分化过程中起着重要的作用。Coucouvanis et al[19]通过对BMP突变干细胞的研究发现,外胚层细胞分泌的BMP信号分子在脏壁内胚层的分化过程中起着重要的作用。Becker et al[20]在对F9细胞形成的拟胚体进行原位杂交时发现，Indian hedgehog (Hh) 在分布于拟胚体外周的内胚层细胞中表达明显升高，而内部的细胞表达量较低；拟胚体经过Hh拮抗剂cAMP和forskolin处理后，Hh表达量明显降低，同时外周的原始内胚层细胞开始向腔壁内胚层(parietal endoderm)转变，因此认为，Hh信号可能也参与了拟胚体原始内胚层的分化过程。上述研究显示，拟胚体中定型内胚层的分化发育基本上模拟了胚胎发育期肝脏的分化过程，因此为利用拟胚体开展肝脏细胞的分化研究提供了理论依据。
[7] Dufort, D., L. Schwartz, K. Harpal, et al., The transcription factor HNF3beta is required in visceral endoderm for normal primitive streak morphogenesis. Development, 1998. 125(16): p. 3015-25.
[8] Abe, K., H. Niwa, K. Iwase, et al., Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Exp Cell Res, 1996. 229(1): p. 27-34.
[9] Duncan, S.A., K. Manova, W.S. Chen, et al., Expression of transcription factor HNF-4 in the extraembryonic endoderm, gut, and nephrogenic tissue of the developing mouse embryo: HNF-4 is a marker for primary endoderm in the implanting blastocyst. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91(16): p. 7598-602.
[10] Patient, R.K. and J.D. McGhee, The GATA family (vertebrates and invertebrates). Curr Opin Genet Dev, 2002. 12(4): p. 416-22.
[11] Fujikura, J., E. Yamato, S. Yonemura, et al., Differentiation of embryonic stem cells is induced by GATA factors. Genes Dev, 2002. 16(7): p. 784-9.
[12] Sousa-Nunes, R., A.A. Rana, R. Kettleborough, et al., Characterizing embryonic gene expression patterns in the mouse using nonredundant sequence-based selection. Genome Res, 2003. 13(12): p. 2609-20.
[13] Asahina, K., H. Fujimori, K. Shimizu-Saito, et al., Expression of the liver-specific gene Cyp7a1 reveals hepatic differentiation in embryoid bodies derived from mouse embryonic stem cells. Genes Cells, 2004. 9(12): p. 1297-308.
[14] Kubo, A., K. Shinozaki, J.M. Shannon, et al., Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development, 2004. 131(7): p. 1651-62.
[15] D'Amour, K.A., A.D. Agulnick, S. Eliazer, et al., Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol, 2005. 23(12): p. 1534-41.
[16] Desbaillets, I., U. Ziegler, P. Groscurth, et al., Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol, 2000. 85: p. 645-51.
[17] Li, X., Y. Chen, S. Scheele, et al., Fibroblast growth factor signaling and basement membrane assembly are connected during epithelial morphogenesis of the embryoid body. J Cell Biol, 2001. 153(4): p. 811-22.
[18] Esner, M., J. Pachernik, A. Hampl, et al., Targeted disruption of fibroblast growth factor receptor-1 blocks maturation of visceral endoderm and cavitation in mouse embryoid bodies. Int J Dev Biol, 2002. 46: p. 817-25.
[19] Coucouvanis, E. and G.R. Martin, BMP signaling plays a role in visceral endoderm differentiation and cavitation in the early mouse embryo. Development, 1999. 126(3): p. 535-46.
[20] Becker, S., Z.J. Wang, H. Massey, et al., A role for Indian hedgehog in extraembryonic endoderm differentiation in F9 cells and the early mouse embryo. Dev Biol, 1997. 187(2): p. 298-310.
ES细胞的生物场,导致其立体化生长
其自我分化出的细胞,因为环境不佳死亡.不知是啥细胞
诱导分化应该有严格的窗口期,早了晚了都没用.细胞分化一直是动态过程
共享一下！！