庆祝上市 全新改版

【讨论】生物样本前处理技术

样本前处理技术在分析方法中占有极其重要的地位,很多分析问题都可以通过样本前处理解决,本文将对样本前处理过程中遇到的问题和样本前处理方法进行综述,以期形成一个系统。
本文将分为
1.样本分类及采集
2.初步处理
3.游离药物分离
4.萃取技术
5.萃取后过程
五个部分进行分别阐述。
其中有不少为个人观点,希望各位战友能不吝指正(纠正错字,纠正观点,进行讨论都欢迎),希望和园内战友共同学习。
楼主快点介绍吧。
1.1 生物样本分类

生物样本多种多样,有血浆、血清、全血、淋巴、唾液、各种组织、毛发、尿液、胆汁、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便以及呼出的气体。(以下文字主要摘自《体内药物分析》姚彤伟编著 2001年)生物样品可大致分为
①均匀样品:血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液、乳汁和性腺分泌液等体液;
②非均匀样品:心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、生殖器官、脑、体脂、胸腺肾上腺和骨骼肌等11种器官、组织。
Ruth Endacott[1]总结了临床样本采集时需要注意的问题以使采样够用和适用 。

[1]:Endacott R, Botti M. Clinical research 3: sample selection. Intensive Crit Care Nurs. 2005 Feb;21(1):51-5.

1.2 生物样品采集

1.2.1 血样

1.2.1.1 组成
血样包括血浆、血清和全血,其中最常用的是血浆。一般认为,药物在体内达到稳定状态时,血浆中药物浓度是与药物在作用点的浓度紧密相关的,即血浆中药物浓度可以反映药物在体内(靶器官)的状况,而且血浆中药物浓度的数据报道较多,可供借鉴。
欲借助血药浓度来了解药物体内的转运规律和用于剂量调整, 应待药物在血液中分布均匀后再取样。直接抽取动脉血或自心脏取血无疑是最理想的方法,因为动脉血中的药物已充分混匀,但此法仅适用于动物实验研究。就采血方式而言,目前使用较多的方法是自静脉采血,并且视采血次数的多少和实验方法需要,一般每次采血1-5ml。做动物实验时,采血量不宜超过动物总血量的十分之一,以免因血流动力学改变而影响研究结果。表1列出常见动物的采血方法。标准的犬类或猫类动物收集血样方法参见Lucas RL 的综述。血样储存及储存条件参见下表2。

1.2.1.2 血浆及血清

血浆(plasma)的取得是在加肝素、草酸盐、枸橼酸等抗凝剂的全血经离心后分取上层清液,其量约为全血的一半。血清(serum)则是由血液中纤维蛋白原等影响下引起血块凝结而析出,离心后取上层清液而得,血块凝结时,往往易造成药物吸附的损失。通过制备后的血清一般可以得到全血的40%,而血浆会比血清多,大约占全血的50%,个体差异较大 。
血清和血浆有以下三点区别:1。 血清中没有纤维蛋白原 2。 血清中无参与凝血机制的血浆蛋白 3。 血浆无一些凝血过程中血小板释放的物质。
在药代研究中两者各有优缺点:
1。 血浆中含有抗凝物质(肝素或EDTA),可能会干扰化合物的检测(结合等),血清则无。
2。 血浆中蛋白稍多,可能会在SPE中产生诸如堵柱子等情况,干扰样本制备过程(这一点其实差别不明显)。
3。 血浆制备快速,直接低温或常温离心后即可分离,血清制备耗时较长。这一点对药代试验影响较大,因为给药后4小时内一般取血点都较为密集。
但血清分离胶的出现可解决这个问题,详见本文2.1.2节。
4。 血清的凝血过程可能会因为与药物产生吸附作用,从而减少血清的含量,并且有可能造成浓度不平行现象。
血样采取量受到一定限制,尤其是连续取样时,病人感到负担,不易得到配合。血样一般每次取1-5mL,但随着高灵敏度测定方法的建立,取样可少到0.1-0.3mL,可改用手指取血,从而易为受试者接受。

1.2.1.3 全血

全血(whole blood)也应加入抗凝剂混匀,防止凝血。
对大多数药物来说,血浆浓度与红细胞中浓度成正比,全血不能提供更多数据,全血药物浓度往往不能很好反映药物的药理作用强度,不能作为作用部位药浓的可靠指标。常选用血浆或血清进行体内药物分析,其原因如下:
1. 血细胞中药物暂时仅作为药物“储库”而失去药理作用,不是反映作用部位药浓的改变,因而不能与药效建立相关关系。
2. 血细胞密集现象。有一些药物如米帕林,它主要集中于白细胞内,只要有生理病理因素导致白细胞增加,就会引起全血药物浓度相应升高,其全血药物浓度变化仅反映白细胞数量的改变,而不是反映作用部位药浓的改变。有些药物(如氯噻酮)可与红细胞结合,其动力学行为与在血浆中不同。
3. 全血净化手续较烦、尤其是溶血后,血色素等可能会给测定带来影响。
但有时必须使用全血进行体内药代动力学研究。在如下情况下,需要使用全血进行PK研究:
1. 如环孢A广泛分布于血液各成分中,已采集的血液样品内CsA在血浆、单核细胞和红细胞中的分布会随室温发生变化,见表3。
温度升高后CsA自红细胞中释放量增多,血药浓度上升,因此抗凝血离心分离血浆过程中,室温对血浆药浓就有影响,并且难以控制。抗凝血即使在同一室温条件下,不同时间离心的血浆中CsA浓度亦有变化,在0-1hr内药浓逐渐降低,1-3小时才恒定。另外,由于CsA有效血药浓度较低,并且药物又大量分布于血细胞中,因此血浆/血清测定其浓度时,达不到仪器检测灵敏度要求。鉴于上述原因,在进行CsA PK研究时就常使用全血样品,而不用血浆或血清[2]。
2. 有时作药物筛查时也会使用全血样本。
全血样品是由血浆和血细胞(包括抗凝剂)组成,是非均匀溶液,测定时必须使血细胞破裂(如测定CsA时加入氢氧化钠,超声或冻融)使之成为均匀溶液。

[2]:《生物药物分析(第二版)》 曾经泽 1998年 p33

1.2.1.4 溶血

血浆如果处理不当会造成溶血现象,溶血大致由以下几方面造成:
a 强烈振荡(包括真空管采血时,抽血针内径太细而导致红细胞破裂;血液注入容器中时未取下针头,或用力推出产生大量气泡;抽血速度过快针尖在静脉中探来探去;注射器与针头连接不好)
b 加入渗透压低于0.9%生理盐水的溶液导致红细胞破裂
c 将全血冷冻导致红细胞破裂
d 一些临床原因,如在有血肿的地方采集血样;病人自身有溶血性疾病;压脉带捆扎时间过长,淤血过久(为避免淤血,压脉带压迫时间最好不要超过三十秒);穿刺不顺利损伤组织过多;抽血消毒时酒精未干就进行抽血;注射器和容器不干燥,不清洁。

1.2.2 尿样

尿药测定主要用于药物剂量回收、药物肾清除率及代谢物类型等研究,也可用于乙酰化代谢和氧化代谢多态性等研究。体内药物清除主要是通过尿液排出,药物以原型或代谢物及缀合物形式排出。尿液药物浓度较高、收集量可以很大,但尿液浓度变化较大,所以要测定一定时间内药物总量(一般收集4小时内累计量),这就需要记录排出的尿液体积及尿药浓度,若药物排泄与尿液pH有关,还需要测定尿液的pH。
尿样的优缺点:所有体液样品中尿样最容易获得,并且样品量多.内含药物(母体药物与代谢物)浓度高,正常尿液中仅含微量蛋白,不需去蛋白处理,所以尿样常用作药物体内代谢研究的首选样品。但是,由于尿中药物浓度改变不直接反映血药浓度,并且在尿液排出过程中,不仅包括肾小球的滤过,还包括肾小管的重新吸收,因此,尿液与血液中药浓的相关性很不理想。 此外,尿液的采集还具有在短时间内不可能多次取样,排尿时间较难掌握以及不易采集完全的缺点。而且,尿液成分复杂,已知内含具有紫外吸收的化合物就达数十种,其中很多是极性高的化合物,部分能随药物一道混入提取物中,当用HPLC—UV测定时,常出现特大的紫外吸收杂质峰,因此,分析尿药浓度时,应选择合适的萃取条件,使样品充分净化后再测定。相比血浆而言,尿样还是比较干净的。

1.2.3 唾液(saliva)

1.2.3.1 唾液组成
唾液用作药浓监测及药代动力学研究的报道近年逐渐增多。唾液中药物浓度通常与血浆浓度相关,因此利用唾液作为样本,就成为一种简便的、无损害的并能反映血药浓度的方法。唾液的采集不受地点、时间的限制,容易获得,且许多用于血浆测定的方法稍加改进即可用于唾液的药浓测定。唾液是分别由腮腺、颌下腺、舌下腺及口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌汇集而成的混合液体。唾液分泌量每日约1200mL,pH范围一般在6.2-7.4之间。唾液内含电解质与细胞外液相似,如含K+, Na+, Cl-颌HCO3-,以及蛋白质、粘液和淀粉酶等有机成分,蛋白含量很低,仅为血浆中的十分之一左右。

1.2.3.2 唾液采集
唾液的采集一般是在漱口后15min左右,收集口腔内自然流出的唾液(混合唾液)。若需专门收集某一腺体(如腮腺)分泌的唾液,则需用导管将其导出,分开收集。采集混合唾液也可使用刺激唾液分泌的方法,如咀嚼一些惰性材料(如石蜡或塑料片)或用味觉刺激法(如用酒石酸、维生素C等)。刺激唾液分泌方法可获得大量唾液,但或引起唾液成分改变。唾液样品收集好后,应离心分出上清液,将黏附蛋白去除后,冷冻保存直至测定。

1.2.3.3 唾液样品的优缺点
唾液样品的优点是采样为非伤害性方法(nonincasive method), 病人易接受,可避免穿刺血管采样时可能引起的交叉感染。唾液采样不受时间、地点限制,一些灵敏度较高的血药浓度分析方法可直接或稍加改进后用于测定唾液药浓。 目前还发现一些药物在唾液中的浓度与血浆中游离浓度十分接近,存在用唾液药浓代替血浆中游离药浓,直接与药物药理作用强度相联系的可能性。
唾液样品的缺点是唾液药浓一般低于血浆药浓(见表3),并且不同唾液腺分泌不同的唾液,其成分也不相同,即使同一唾液腺也可因是否受到刺激或因生理、病理状况的改变,其分泌的成分有差异。 采用刺激法增加唾液分泌虽然可获得较多样品,但可能影响药物的浓度。当唾液pH变化时,还会影响一些弱酸性药物和弱碱性药物(pKa 5.5-8.5)的电离,电离后的药物亲脂性降低。因为药物在唾液隔室内正常pH条件下,主要呈非电离形式存在,有利于药物向血浆内扩散,由于血浆pH稍高(pH7.4),大量药物会在血浆中呈电离形式存在,因此唾液中药浓(S)与血浆中药浓(P)的比值(S/P)偏低(通常低于1)。与之相反,碱性药物的S/P值偏高。
有关血药浓度中游离型药物浓度与总浓度的比率(F/T)、唾液与血浆浓度的比率(S/P),以及它们之间的相关性的研究已为多数研究者所重视。一些药物的F/T和S/P比率见表4。
由于游离血浆浓度与血药总浓度相比更与药物的药理作用强度密切相关,所以应该测定游离血浆药物浓度,但目前测定游离血药浓度的方法都很复杂,使其实际应用受到了一定限制。近十年以来已陆续报道一些药物的唾液浓度(S)与血浆中游离药浓(UP)相近,提示有可能利用测定唾液药浓代替游离血药浓度监测。表5列出了部分药物的S/UP值供参考。

1.2.3.4 STDM现状
近年来,已有文献 报道唾液中药物检测的现状。血流供应全身各器官、组织,故血浆(或血清)中的药浓能与作用部位周围生物相中的药物浓度迅速达到平衡,因此血药浓度与药物的药理作用强度直接相关。与血中药物相比,唾液中的药物未同作用部位直接接触,必须通过血液间接与作用部位相联系。欲用唾液药浓监测(STDM)代替血药浓度监测,必须首先确定唾液中药浓 (S) 与血浆中药浓 (P) 有密切的相关性。一般用S/P值及其变异来表示唾液药浓与血浆药浓的相关性,其测定方法如下:选择适当例数给药后的病人或健康志愿者,在收集唾液样品时,同时抽取静脉血(制备成血浆或血清),并在给药后不同时间取样,得到若干份同时采取的含药物浓度高、中、低的唾液样品和血浆样品,分别测定出各份样品中的药物浓度,计算出s/P值及均值。数据处理可采用作图法,即以血浆药浓为横坐标,唾液药浓为纵坐标,将得到的每对药浓数据描绘在图上,作成相关性图;另外,也可将两组数据进行直线回归处理,回归直线的斜率即为S/P值,如图1所示。

欢迎拍砖,欢迎讨论和指正!
1.2.4 不均匀样本的采集
不均匀样本分析时仅需取其中一部分进行测定,对动物而言,则可取全部组织脏器进行均匀化,在均匀化前必须使用生理盐水对其中表面黏着的血液等物质进行清洗,然后以一定比例(如1:4,w/v)与生理盐水混合。需均匀化处理的生物材料一般为半固体或粘稠样品,半固体样品与生理盐水混合后可置匀浆机中磨成匀浆,粪便可加入少量甲醇或其他液体搅匀,粘稠样品可用超声波匀化处理。不均匀样本采集时需要有一定代表性,如果取全部组织,则需要认清楚位置。称重后全部均匀化,取其一部分进行测定。

1.2.5 呼气的采集
呼气采集需要注意收集器皿。

1.3 样本前处理所用仪器
1.3.1 离心机
1.3.1.1 离心技术

离心技术在生物科学,特别是在生物化学和分子生物学研究领域,已得到十分广泛的应用,每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备,生物样品悬浮液在高速旋转下,由于巨大的离心力作用,使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降,从而与溶液得以分离,而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。
基本原理: 当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时,此离心力“F”由下式定义,即:
F = m•a = m•ω2 r
a — 粒子旋转的加速度, m — 沉降粒子的有效质量,ω—粒子旋转的角速度, r—粒子的旋转半径( cm )。

1.3.1.2 离心力换算
离心力常用地球引力的倍数来表示,因而称为相对离心力 “ RCF ”。或者用数字乘“g”来表示,例如25000×g,则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在离心场中,作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数,单位是重力加速度“g”(980cm/sec2),此时“RCF”相对离心力可用下式计算:
∴ RCF = 1.119×10-5×(rpm)2× r
( rpm — revolutions per minute每分钟转数,r/min,r单位为cm )
由上式可见,只要给出旋转半径r,则RCF和rpm之间可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异,使每台离心机的离心管,从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的,所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“rav”代替:
rav=( r min+rmax) / 2
一般情况下,低速离心时常以转速“rpm”来表示,高速离心时则以“g” 表示。计算颗粒的相对离心力时,应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同,即沉降颗粒在离心管中所处位置不同,则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时,通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”,因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值(RCFav),即离心管中点的离心力。
下个网页可以进行g和rpm间的换算:
>

如果有什么不对的地方或者我没有注意到并且重要的地方或大家感兴趣的地方还请各位战友/同行发言,谢谢了。
谢谢楼主的宝贵经验
2.3.1.3离心机的主要构造和类型
离心机可分为工业用离心和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机,制备性离心机主要用于分离各种生物材料,每次分离的样品容量比较大,分析性离心机一般都带有光学系统,主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质,依据待测物质在离心场中的行为(用离心机中的光学系统连续监测),能推断物质的纯度、形状和分子量等。分析性离心机都是超速离心机。

1. 制备性离心机可分为三类:
⑴ 普通离心机:最大转速6000 rpm左右,最大相对离心力近6000×g,容量为几十毫升至几升,分离形式是固液沉降分离,转子有角式和外摆式,其转速不能严格控制,通常不带冷冻系统,于室温下操作,用于收集易沉降的大颗粒物质,如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动,电机的碳刷易磨损,转速是用电压调压器调节,起动电流大,速度升降不均匀,一般转头是置于一个硬质钢轴上,因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要,否则会损坏离心机。
⑵ 高速冷冻离心机:最大转速为20000~25000 rpm(r/min),最大相对离心力为89000×g,最大容量可达3升,分离形式也是固液沉降分离,转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统,以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量,离心室的温度可以调节和维持在0~40 oC,转速、温度和时间都可以严格准确地控制,并有指针或数字显示,通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作,但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。
⑶ 超速离心机:转速可达50000~80000 rpm,相对离心力最大可达510000×g,最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等,离心容量由几十毫升至2升,分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离,离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现,使生物科学的研究领域有了新的扩展,它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离,还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。
超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。超速离心机的驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速,或直接用变频感应电机驱动,并由微机进行控制,由于驱动轴的直径较细,因而在旋转时此轴可有一定的弹性弯曲,以适应转头轻度的不平衡,而不致于引起震动或转轴损伤,除速度控制系统外,还有一个过速保护系统,以防止转速超过转头最大规定转速而引起转头的撕裂或爆炸,为此,离心腔用能承受此种爆炸的装甲钢板密闭。
温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感受器直接并连续监测离心腔的温度,以保证更准确更灵敏的温度调控,这种红外线温控比高速离心机的热电偶控制装置更敏感,更准确。超速离心机装有真空系统,这是它与高速离心机的主要区别。离心机的速度在2000 rpm以下时,空气与旋转转头之间的磨擦只产生少量的热,速度超过20000 rpm时,由磨擦产生的热量显著增大,当速度在40000 rpm以上时,由磨擦产生的热量就成为严重问题,为此,将离心腔密封,并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统抽成真空,温度的变化容易控制,磨擦力很小,这样才能达到所需的超高转速。

2. 转头:
⑴ 角式转头:角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的,其上有4~12个装离心管用的机制孔穴,即离心管腔,孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20~40度之间,角度越大沉降越结实,分离效果越好。这种转头的优点是具有较大的容量,且重心低,运转平衡,寿命较长,颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管,然后再沿管壁滑向管底,因此管的一侧就会出现颗粒沉积,此现象称为“壁效应”,壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱,影响分离效果。
⑵ 荡平式转头:这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶(离心套管)构成。当转头静止时,吊桶垂直悬挂,当转头转速达到每分钟200到800转时,吊桶荡至水平位置,这种转头最适合做密度梯度区带离心,其优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中,离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴,而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度,因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。其缺点是颗粒沉降距离长,离心所需时间也长。
⑶ 区带转头:区带转头无离心管,主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成,转子桶中装有十字型隔板装置,把桶内分隔成四个或多个扇形小室,隔板内有导管,梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入,通过这些导管分布到转子四周,转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头,在径向的散射离心力作用下,颗粒的沉降距离不变,因此区带转头的“壁效应”极小,可以避免区带和沉降颗粒的紊乱,分离效果好,而且还有转速高,容量大,回收梯度容易和不影响分辨率的优点,使超离心用于制备和工业生产成为可能。区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头,耐腐蚀要求高,操作复杂。
⑷ 垂直转头:其离心管是垂直放置,样品颗粒的沉降距离最短,离心所需时间也短,适合用于密度梯度区带离心,离心结束后液面和样品区带要作九十度转向,因而降速要慢。
⑸ 连续流动转头:可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离,转头与区带转头类似,由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成,离心时样品液由入口连续流入转头,在离心力作用下,悬浮颗粒沉降于转子桶壁,上清液由出口流出。

3. 离心管:
离心管主要用塑料和不锈钢制成,塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸酯(PC),聚丙烯(PP)等,其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透明),硬度小,可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形,抗有机溶剂腐蚀性差,使用寿命短。不锈钢管强度大,不变形,能抗热,抗冻,抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品,如强酸、强碱等。塑料离心管都有管盖,离心前管盖必须盖严,倒置不漏液。管盖有三种作用:①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时,这点尤其重要。②防止样品挥发。③支持离心管,防止离心管变形。

4. 分析性离心机:
分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统,以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。
分析性超速离心机的转头是椭圆形的,以避免应力集中于孔处。此转头通过一个有柔性的轴联接到一个高速的驱动装置上,转头在一个冷冻的和真空的腔中旋转,转头上有2~6个装离心杯的小室,离心杯是扇形石英的,可以上下透光,离心机中装有一个光学系统,在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质,在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片,在分析离心杯中物质沉降情况时,在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜,结果在检测系统的照像底板上产生了一个“峰”,由于沉降不断进行,界面向前推进,因此峰也移动,从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。
分析性超速离心机和主要特点就是能在短时间内,用少量样品就可以得到一些重要信息,能够确定生物大分子是否存在,其大致的含量,计算生物大分子的沉降系数,结合界面扩散,估计分子的大小,检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例,测定生物大分子的分子量,还可以检测生物大分子的构象变化等。
2.3.1.4 制备性超速离心的分离方法

1. 差速沉降离心法:

这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心,使沉降速度不同的颗粒,在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。
差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时,在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀,分出的上清液在加大转速下再进行离心,又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液,如此多次离心处理,即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的,仍杂有其它成分,需经过2~3次的再悬浮和再离心,才能得到较纯的颗粒。
此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒,其优点是:操作简易,离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子。缺点是:须多次离心,沉淀中有夹带,分离效果差,不能一次得到纯颗粒,沉淀于管底的颗粒受挤压,容易变性失活。
不错,帮你顶个。~加紧作业
来点批评意见吧:)
能不能谈谈怎么样完全地去除蛋白质,有哪几种方法?那种好呢?
抓紧学习
呵呵,pp将在3.5节中详细介绍
先提供一个pp效率表格,以供参考。
表格来自Blanchard J. Evaluation of the relative efficacy of various rechniques for deproteinizing plasma samples prior to high-performance liquid chromatographic analysis. J Chromatogr. 1981, 226:455.(《生物药物分析(第二版)》 曾经泽 1998年引述)
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=554 height=253 title="Click to view full 新图片.png (554 X 253)" border=0 align=absmiddle>
您的位置:医学教育网 >> 医学资料