肠道杆菌的鉴别是医学微生物学中重要的内容，可从多个方面进行。

首先是形态与染色特性。肠道杆菌均为革兰氏阴性杆菌，大小相似，形态上无显著特征，所以单纯依靠形态染色难以准确鉴别不同的肠道杆菌，通常需要结合其他方法。

培养特性也是重要的鉴别依据。肠道杆菌为需氧或兼性厌氧菌，营养要求不高，在普通琼脂平板上就可生长。不过在不同的选择培养基和鉴别培养基上，它们会有不同的生长表现。例如，在伊红美蓝培养基上，大肠杆菌能分解乳糖产酸，使菌落呈紫黑色且有金属光泽；而沙门菌、志贺菌等不分解乳糖，菌落为无色透明。SS培养基可抑制革兰氏阳性菌和部分大肠杆菌的生长，有利于肠道致病菌的分离，伤寒沙门菌等在SS培养基上形成无色透明或半透明的菌落。

生化反应在肠道杆菌鉴别中具有关键作用。不同的肠道杆菌具有不同的酶系统，对糖类和蛋白质的分解能力各异。如大肠杆菌能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，而沙门菌不发酵乳糖，能发酵葡萄糖产酸不产气（伤寒沙门菌除外，它产酸不产气）。此外，靛基质试验、甲基红试验、VP试验和枸橼酸盐利用试验（IMViC试验）常用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌等。

血清学试验能利用已知的特异性抗体来检测未知的肠道杆菌抗原。如用伤寒沙门菌的O、H抗原和甲、乙、丙型副伤寒沙门菌的H抗原与患者血清做肥达试验，可辅助诊断伤寒和副伤寒。

另外，还可以通过分子生物学方法进行鉴别，如PCR技术可快速、特异地检测肠道杆菌的特定基因序列，有助于准确鉴别不同的菌种和菌株。噬菌体分型、细菌素分型等方法也可用于某些肠道杆菌的鉴别和流行病学调查。通过综合运用这些方法，能够较为准确地鉴别肠道杆菌。