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利用dcas9和超高灵敏度蛋白质谱平台构建位点特异dna-蛋白质互作网络

2018-03-02 09:42
随着功能基因组学的飞速发展,对调控基因表达的顺式(cis-)和反式(trans-)作用元件进行系统研究成为当前急需填补的领域空白。利用生物素化的(biotinylated)功能缺失的dcas9系统加上能与我们所感兴趣位点能够形成特定结合的SgRNA,在原位去分离纯化我们感兴趣位点DNA以及与这个位点有特定结合的蛋白质复合物。我们利用该系统去研究在白血病细胞系K562中,与血红蛋白(Hemoglobin)的几个亚型HBB、HBG、HBE1、以及与调控相关的几个重要的增强子HS1、HS2、HS3、HS4和HS5 上面所结合的蛋白质复合物。在该实验中,我们利用Streptavidin的免疫特异性树脂球对带有Biotin基团的蛋白质复合物进行纯化。然后进行了iTRAQ的标记,最后,样品由高灵敏度的全蛋白定量平台进行定量的分析。在该实验中,我们能够检测到如GATA1,TAL1,NFE2等与血红蛋白的表达息息相关的已知的转录因子。与此同时,我们也能发现新的蛋白质核孔蛋白NUP98以及NUP153结合在hemoglobin基因的位点上面。然后,我们利用该方法研究了跟疾病关系密切的位点,HBE1到HBD之间的区域。通过蛋白质组学,我们发现与HBD-1K相结合的蛋白质的数量要多于与HBD-1.5K以及HBD-2K的蛋白我们同时也测定了与这些位点有相互作用的DNA区域,我们也同样发现与HBD-1K相结合的DNA的数量要多于与HBD-1.5K以及HBD-2K的DNA数量。综合以上的证据,HBD-1K是一个重要的疾病相关基因,通过CRISPR技术敲除了HBD-1K之后,我们能够发现HBG的基因转录受到了明显的影响,而HBB的转录则大致不变。我们的技术表明了,我们能对特定的DNA区域,即使是对单拷贝的DNA位点能够进行全面深度的蛋白质复合物的解析。这些解析的结果能够帮助我们发现那些对特定基因起着重要调控作用的蛋白质,对研究这些基因的激活与静默机制有着至关重要的作用。