1.siRNA实验应该有阴性对照；
2.通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照；
3．Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性；
4．阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因同源性很低。
B．荧光标记阴性对照
1. RNAi negative control与哺乳动物基因无同源性；
2.通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况；
3.可用于优化转染条件和评价转染效率；
4.具备很好的pH耐受性，在活细胞中更稳定。
C．siRNA阳性对照
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。您可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法是可靠的。
siRNA阳性对照较为常用的如下：
1 LaminA/C
2 GFP22
3 Luciferase GL2
4 MAPK1
5 Beta-Actin
6 Vimentin
7 P53
8 GAPDH
9 Cyclophilin B
D．转染试剂对照
对于一个完善的对照系统，转染试剂对照(Mock transfection )是不可缺的。转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。
E．避免Off-target对照
对于RNAi研究来说，在哺乳动物中，off-target效应是一个十分关注的问题。有大量的报道，一个siRNA影响多个基因的表达。因此，大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验，然后分析各自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。
谢谢分享。有启发。
多谢分享!
非常感谢分享
基因沉默 wrote:
A．普通阴性对照
1.siRNA实验应该有阴性对照；
2.通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照；
3．Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性；
4．阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因同源性很低。
B．荧光标记阴性对照
1. RNAi negative control与哺乳动物基因无同源性；
2.通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况；
3.可用于优化转染条件和评价转染效率；
4.具备很好的pH耐受性，在活细胞中更稳定。
C．siRNA阳性对照
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。您可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法是可靠的。
siRNA阳性对照较为常用的如下：
1 LaminA/C
2 GFP22
3 Luciferase GL2
4 MAPK1
5 Beta-Actin
6 Vimentin
7 P53
8 GAPDH
9 Cyclophilin B
D．转染试剂对照
对于一个完善的对照系统，转染试剂对照(Mock transfection )是不可缺的。转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。
E．避免Off-target对照
对于RNAi研究来说，在哺乳动物中，off-target效应是一个十分关注的问题。有大量的报道，一个siRNA影响多个基因的表达。因此，大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验，然后分析各自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。
这位师兄，我想问问您阴性对照和空白对照的区别是什么啊，我做RNA干扰的体内实验，用裸鼠造模的，我的分组老板说没必要弄空白对照，只有阴性就可以了，但有的师兄说应该有空白对照，您能帮我解答一下吗？谢谢
阴性对照就是必须转染一个与目的基因序列同源性极低的无关序列的siRNA oligo duplex进入细胞或者注射入体内，它的目的是排除序列的非特异性效应;而空白对照是不加任何siRNA oligo duplex.可以用转染试剂和培养基混合后直接转染，它还可以排除转染试剂毒性效应。
谢谢分享，看来楼主是这方面的高手了阿
非常感谢!
很不错啊，又学了不少，谢谢楼主！
楼主，请问siRNA设计软件能提供一份吗？先谢谢了，请发luyunxia0514@tom.com
基因沉默:
你好,
我做阳性对照选GAPDH ,我是自己构建载体在体内表达的,如何做阳性对照啊
汪永强 wrote:
基因沉默:
你好,
我做阳性对照选GAPDH ,我是自己构建载体在体内表达的,如何做阳性对照啊
您可以查询已经证实的也就是validated GAPDH siRNA sequence构建到您的载体上作为阳性对照，validated GAPDH siRNA sequence可以从已经公开发表的文章中获得！
luyunxia8664 wrote:
楼主，请问siRNA设计软件能提供一份吗？先谢谢了，请发luyunxia0514@tom.com
您搜索一下基因沉默的帖子，有有关设计软件和设计方案选择
楼主，你好！
在做基因干扰的后续试验部分－FCM的时候，检测细胞周期或是凋亡需要设对照。是用转染试剂对照(Mock transfection ) 还是阴性对照(RNAi negative control）的细胞做对照呢？谢谢！
bill205 wrote:
楼主，你好！
在做基因干扰的后续试验部分－FCM的时候，检测细胞周期或是凋亡需要设对照。是用转染试剂对照(Mock transfection ) 还是阴性对照(RNAi negative control）的细胞做对照呢？谢谢！
我们一般设计Mock transfection,no transfection作为对照!
谢谢“基因沉默”的回复
还想问下：你这里说的no transfection 具体是指的没有任何处理过的肿瘤细胞吗？还有做流式细胞术设的对照是一个吧，你做的时候Mock transfection和no transfection细胞都可以做为对照吗？
bill205 wrote:
谢谢“基因沉默”的回复
还想问下：你这里说的no transfection 具体是指的没有任何处理过的肿瘤细胞吗？还有做流式细胞术设的对照是一个吧，你做的时候Mock transfection和no transfection细胞都可以做为对照吗？
是对,是没有处理的肿瘤细胞.是的,我一般用Mock transfection作为对照.
请问大鼠的GAPDH阳性对照可以买来吗，LaminA/C在各种细胞都高表达吗，谢谢
ahui wrote:
请问大鼠的GAPDH阳性对照可以买来吗，LaminA/C在各种细胞都高表达吗，谢谢
已经有商业化的大鼠的GAPDH阳性对照可以买，不管是GAPDH还是LaminA/C都不是在每种细胞都是一致的表达水平！
基因沉默 wrote
C．siRNA阳性对照
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。您可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法是可靠的。
siRNA阳性对照较为常用的如下：
1 LaminA/C
2 GFP22
3 Luciferase GL2
4 MAPK1
5 Beta-Actin
6 Vimentin
7 P53
8 GAPDH
9 Cyclophilin B
请教下楼主，阳性对照哪个是比较确定的，已经被不少实验室确证过的？哪个公司的比较好？有文献吗？谢谢！
这个帖子很好, 不要沉了
SmallDonkey wrote:
请教下楼主，阳性对照哪个是比较确定的，已经被不少实验室确证过的？哪个公司的比较好？有文献吗？谢谢！
这些都是常用的，都有已经validated 的target!文献也有不少！不过大部分是人和小鼠的target!
这些基本上在国外的大实验室已经使用和证实过并且有不少已经商业化！
真是柳暗花明又一村,谢谢"基因沉默",非常感谢,以后还要向您多多请教!
尊敬的基因沉默老师，您好！我是新手，看了您的《siRNA对照解析》很受启发，但转染试剂对照 ，避免Off-target对照不明白，您能否详细解析一下？先谢谢了！
请帮忙 wrote:
尊敬的基因沉默老师，您好！我是新手，看了您的《siRNA对照解析》很受启发，但转染试剂对照 ，避免Off-target对照不明白，您能否详细解析一下？先谢谢了！
转染试剂对照组，就是只加转染试剂，不加siRNA oligos的对照组，可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。
避免off-target效应对照组，就是选择多对siRNA（即多个靶点）,它们分布在基因的不同位置,并且在这些靶点有不同的基因敲减效果，有相似的基因表达图谱。这样说明这些靶点产生了一致的效果，没有off-target效应
谢谢基因沉默老师的解答,非常感谢!我想向您再请教:您所提到的对照,在瞬时转染是否都要用到?刚接触siRNA ,看国内外的文献，其对照设置不一。因为我实验目的是干扰靶蛋白了解其对细胞增殖的影响，在设置对照时是不是干扰前期实验需要空白对照，阴性对照，阳性对照，避免off-target效应对照；而在后续实验是设空白对照，避免off-target效应对照，转染试剂对照。再次感谢！
请帮忙 wrote:
谢谢基因沉默老师的解答,非常感谢!我想向您再请教:您所提到的对照,在瞬时转染是否都要用到?刚接触siRNA ,看国内外的文献，其对照设置不一。因为我实验目的是干扰靶蛋白了解其对细胞增殖的影响，在设置对照时是不是干扰前期实验需要空白对照，阴性对照，阳性对照，避免off-target效应对照；而在后续实验是设空白对照，避免off-target效应对照，转染试剂对照。再次感谢！
设置对照都是相对的，一般来说，对于刚刚开始做实验的初学者，建议所有的对照都用上，以便在实验中遇到问题较好分析，对于严谨的实验，设置对照是没有坏处的，至于稳定的实验体系已经建立的实验平台，可以减少对照的使用！
基因沉默 wrote:
A．普通阴性对照
1.siRNA实验应该有阴性对照；
2.通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照；
3．Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性；
4．阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因同源性很低。
我的不同意见，供讨论。
中国从2004年开始使用RNA干扰技术，目前已经广泛应用。所以目前使用对照情况有了一些变化。
(1)阴性对照是为了说明某个基因表达减少是由于引入了靶序列，这在研究RNA干扰技术中十分重要，尤其对建立siRNA模型时很重要。但是现在很多RNA干扰不再是对RNA干扰技术研究了，只是把它当为一种技术。如，我要把表达nephrin的基因沉默下来，western证明nephrin蛋白减少就可以了。没有阴性对照，你最多说我不能证明nephrin蛋白减少是RNA干扰导致的，但我的实验只要nephrin减少就可以了，管它是不是RNA干扰的原因。所以，一般在这类实验要求下，可以不用设立阴性对照。
(2)目前有大量文献使用的阴性对照是同一个阴性对照。对照序列只是和人、鼠等没有同源性，但是和目标序列的核苷酸组成并不相同。因为其设立目的主要是说明转入序列并不能都起基因沉默作用，只有转入了目标序列才能基因沉默。所以，阴性对照的最低要求就是和研究物种没有同源性。
RNA干扰技术的教科书近3年没有一点变化，我认为该随技术进步而修改了。以上属个人看法体会，没有看到正式说法。
再次感谢老师们的解答，由于初学siRNA，还有许多不懂，一定向老师们多请教。衷心谢谢了！
我做的质粒转染，请问我设立的是空白对照组（只加培养基和转染试剂）
目的质粒转染组（靶向基因的质粒转染）阳性对照组（与目的质粒相关的另外一个质粒）。这样的分组行吗？总感觉自己的分组有些问题，但是不知道怎么弄？我只有一个质粒，已经合成好的！
谢谢指导
duanxiaochun wrote:
我做的质粒转染，请问我设立的是空白对照组（只加培养基和转染试剂）
目的质粒转染组（靶向基因的质粒转染）阳性对照组（与目的质粒相关的另外一个质粒）。这样的分组行吗？总感觉自己的分组有些问题，但是不知道怎么弄？我只有一个质粒，已经合成好的！
谢谢指导
质粒比较完整的对照组一般如下：
1.空质粒对照组（空白质粒，没有插入片断地对照组）
2.阳性质粒对照组（最好是同一质粒，已经验证有效的序列，例如GAPDH,beta-actin）
3.阴性质粒对照组（插入随机序列的对照组）
4.空白对照组（转染试剂＋培养基）
5.靶序列组（针对目的基因的序列的对照）
请教基因沉默老师：您上述设的对照中，避免off-target效应对照是不是没有设立呢？还是在靶序列组中包含了2-3对siRNA？如果实验中设避免off-target效应对照组，在评价时，是不是有2对siRNA出现＞70%沉默效应，我们可认为不存在off-target效应呢？基因沉默老师，您能讲一下避免off-target效应的评价吗？谢谢！
相似性序列发生Cross－react引起脱靶效应
监测手段：对脱靶效应的监测一般通过基因芯片来监测。Gene expression profiling
避免off-target效应当手段：
选择多对siRNA（即多个靶点）,它们分布在基因的不同位置,并且在这些靶点有不同的基因敲减效果，有相似的基因表达图谱。这样说明这些靶点产生了一致的效果，没有off-target效应
脱靶效应的特性：
转录物表达模式有序列特异性和靶特异性两种
大部分脱靶效应具有siRNA序列特异性
低浓度也可能产生脱靶效应，不仅仅是高浓度能产生脱靶效应的假象。
脱靶效应在蛋白和mRNA水平同时考虑进行分析，要缜密分析和确定分析的时间点。
特别是要确定脱靶效应是否是蛋白被knock－down的次级效应，因此要分时序性进行分析。
对靶蛋白和目的转录本进行半衰期分析或者获取相关的资料。在蛋白效应以前通过表达图谱分析已经确认非次级效应影响。看降解靶转录本和靶蛋白效应时间分水岭可以判定是否为次级基因表达改变所影响的。
从脱靶效应来看，正义和反义链都有可能引起脱靶效应，主要看是哪条链产生干扰作用。脱靶效益可能是独立于基因沉默效应的，可能是序列依赖性的。11-15核苷酸序列相似性的序列都可能产生脱靶效应。正义链的3’和反义链的5’端对基因沉默的贡献相对较大。我们叫其core 序列。
真心谢谢基因沉默老师！
johnchen416
目前有大量文献使用的阴性对照是同一个阴性对照。
请问在哪里能够找到这样的阴性对照序列，或者有哪位老师能给我一个这样的序列？先谢谢大家了！
很急！谢谢！