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探针与分子杂交技术的概述介绍

2020-06-23 18:23 医学教育网
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探针与分子杂交技术的概述介绍,为了帮助大家了解,医学教育网小编为您提供汇总:

探针

探针是一小段单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp),用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链,随后用放射性同位素(通常用磷-32)、萤光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中,而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。

当将探针与样品杂交时,探针和与其互补的核酸(DNA或RNA)序列通过氢键紧密相连,随后,未被杂交的多余探针被洗去。最后,根据探针的种类,可进行放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否,或者何位置含有被测序列(即与探针互补的序列)。

分子杂交技术

分子杂交(molecularhybridization)确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸(叫做探针)间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA,RNA与RNA,或DNA与RNA之间进行,形成DNA-DNA,RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30——50核苷酸长,可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的mRNA。探针必须预先标记以便检出杂交分子。标记方法有多种,常用的为同位素标记法和生物素标记法。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。

使单链DNA或 RNA分子与具有互补碱基的另一DNA或RNA 片断结合成双链的技术。即核酸分子间的杂交。相互杂交的两种核酸分子间有时并非完全一致,但必有一定的相关性。早在1961年有人创建了DNA与RNA间的分子杂交,但至70年代才发展成基因分析中一种重要的分析技术,可鉴定基因的特异性。例如可将具有一定已知顺序的某基因的 DNA片段,标上放射性核素,构成核酸探针,将它通过分子杂交与缺陷的基因结合,产生杂交信号,从而把缺陷的基因显示出来,借此可对许多遗传性疾病进行产前诊断。现又用核酸分子杂交技术诊断乙型肝炎,以及研究其他病毒性疾病和癌瘤的基因结构(癌基因)等。

核酸分子杂交的方法并不复杂。在杂交前先把待分析的DNA加热或加碱使之变性,分开成单链;然后加入放射性核素标记的核酸探针,降温退火,即获带有放射性核素标记的双链杂交分子。1979年又发展成转膜杂交,即将电泳分开的核酸片段,经过转移电泳转移到硝酸纤维素膜上,进行固相杂交反应,用放射自显影检出之。此即著名的萨瑟恩氏印迹法。

无庸置疑,分子杂交的基础是两个核酸分子间的完全一致,或有一定的相似性或相关性。若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷酸以上),可以得到很准确的鉴定结果。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短(如20——30个核苷酸),则难免会出现准确性差的假阳性现象。现又有非放射性核素标记核酸探针,如以碱性磷酸酶标记的酶标核酸探针,以及以生物素标记的核酸探针等,这必将有助于推动分子杂交在临床医学中的广泛应用。

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