肽的顺序分析：公卫助理医师备考

2012-08-03 16:37 医学教育网

2012年公卫助理医师考试即将在9月份开考，医学教育网收集整理了公卫执业助理医师考试基础综合的常考知识点，供各位考生参阅。

在蛋白质一级结构的测定中，肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析也有化学法和酶解法两种。

1）化学法Edman降解法

这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始，逐步降解。将肽先与异硫氰酸苯酯（PTH试剂）在pH8-9条件下作用，肽的NH2末端接到异硫氰酸苯酯的C原子上生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC肽，在强酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏，因而又可出现一个新的N－末端。重复以上的步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH－氨基酸）。这些步骤通常称为Edman氏逐步降解法。所以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。

PTH－氨基酸的鉴定可以用各种层析方法，如纸层析、薄层层析、气相层析和质谱法等，现在多用高压液相层析法。虽然此方法具有很多优点，但是由于操作繁琐，工作量大，所以目前有人根据Edman降解的原理作一系列改进。

下面简单介绍几种方法

A.1967年Edman及Begg介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置，使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。

B.1970年Laursen改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析20？0肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行Edman降解。

固相顺序仪的惰性支持物有：

此法成功的关键是肽段的固定，目前采用C端α羧基固定法，重复法高，其中以高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法（DITC）最好，固定率可达90-95%.

C.另外也有从化学反应的角度考虑，试图改进Edman方法。1976年有人将异硫氰酸苯酯的苯基改变为甲氨偶氮苯，试剂为甲氨偶氨苯异硫氰酸盐（简称DABITC）。这是一种有色试剂，产物DABIH氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时无需染色，用肉眼即可分辨。此方法灵敏度很高，一次分析小肽段只要几个nanomole样品即可，是目前一种很可取的方法。此外也有人将异硫氰酸酯进行35S标记，使分析样品更向微量化方向发展。

2）酶解法肽谱重迭法

分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析结果如下：

Ala.Phe+Gly.Lys.Asn.Tyr+Arg.Trp+His.Val

糜蛋白酶水解

+肽（Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Trp.His.Val）

胰蛋白酶水解

Ala.Phe.Gly.Lys+Asa.Tyr.Arg+Trp.His.Val

将此两套寡肽可以做分析比较，因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala，Phe.如此类推如下

寡肽号	氨基酸组成部分顺序
A-1	Ala·Pha
B-1	Ala·Phe·Gly·Lys
A-2	Gly·Lys·Asn·Tyr
B-2	Asn·Tyr·Arg
A-3	Arg·Trp
B-3	Trp·His·Val
A-4	His·Val
+肽顺序	Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val

水解酶也可运用二肽酶，两组可用同一种酶水解如第一套肽是A桞，C桪，E桭，G桯……第二套肽水解则先将该肽段N端切去一个末位氨基酸，然后再开始二肽酶断裂，结果是A，B桟，D桬，F桮……这样分析比较也可排列出肽段顺序。