【摘要】目的： 探讨重组人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m）对γ射线辐射造血损伤小鼠的影响。 方法： 15只小鼠随机分成3组：照射组、BMP治疗组和对照组，每组5只。 照射组和BMP治疗组均以60Coγ射线7.5 Gy照射200 s，对照组不接受照射。 照射后，照射组和对照组每日腹腔注射生理盐水1 mL，BMP治疗组注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理盐水稀释液，各6 d. 照射后1， 3， 5， 7， 9， 11 d以尾静脉采血观察3组小鼠外周血白细胞、红细胞及血小板变化；照射后11 d观察照射组、BMP治疗组小鼠脾结节形成数变化。 结果： 3组间小鼠的外周血白细胞、血小板数目随时间的变化差异有统计学意义 （P<0.01），而外周血红细胞数目随时间的变化差异无统计学意义（P>0.05）。 与对照组相比，照射组外周血白细胞［如（0.32±0.11）×109 vs （4.05±1.18）×109， 7 d］、红细胞［如（6.73±1.68）×1012 vs （9.09±1.92）×1012， 7 d］、血小板计数［如（26.60±7.47）×109 vs （814.20±187.01）×109， 7 d］显著下降 （P<0.01）；与照射组相比，BMP治疗组外周血白细胞［如（1.61±0.31）×109 vs （0.32±0.11）×109， 7 d］、血小板计数［如（142.60±35.71）×1012 vs （26.60±7.47）×1012， 7 d］显著增高 （P<0.01），外周血红细胞数目虽然增高［如（7.38±2.22）×1012 vs （6.73±1.68）×1012， 7 d］，但差异无统计学意义（P>0.05）；BMP治疗组小鼠脾结节形成数显著多于照射组（P<0.01）。 结论： BMP可提高γ射线放射损伤小鼠各系的造血细胞数目及脾结节形成数，具有促进造血功能恢复的作用。

　　【关键词】  人重组骨形成蛋白2 放射损伤 造血功能 脾结节

　　0引言

　　骨形成蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）属于转化生长因子β（TGFβ）超家族。 研究发现，在小鼠皮下植入重组人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m），可引起间质细胞聚集、软骨形成，随之出现骨替代、骨髓形成及骨塑性［1］。 在大量不同的实验研究中，rhBMP2m 表现出良好的诱骨活性，在临床上对于治疗骨缺损、骨折、牙本质修复等方面有广阔的应用前景。 rhBMP2m可减轻γ射线辐射所致的急性造血损伤，治疗组小鼠的与造血相关指标较照射对照组和对照组有显著性增加（P<0.01），提示rhBMP2m可促进骨髓基质细胞的分化、造血干细胞的形成及骨髓中造血干细胞的增殖，从而改善造血微环境，使辐射损伤后造血功能恢复［2-3］。 本研究旨在探讨rhBMP2m对γ射线辐射造血损伤小鼠的治疗作用。

　　1.材料和方法

　　1.1材料二级Balb/c小鼠15只，雄性，体质量19～21 g，10周龄（第四军医大学实验动物中心提供）；rhBMP2m（第四军医大学基础部教学实验中心提供）使用前溶于生理盐水，稀释浓度为0.5 g/L，60Coγ射线源（第四军医大学辐照中心）。

　　1.2方法

　　1.2.1小鼠急性放射损伤模型的建立15只小鼠随机分成3组：对照组、照射组和BMP治疗组，每组5只。 照射组和BMP治疗组均以60Coγ射线7.5 Gy（剂量率221.09 cGy/min）全身照射200 s，对照组不接受照射。

　　1.2.2治疗照射后，照射组和对照组每日腹腔注射生理盐水1 mL，BMP治疗组注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理盐水稀释液，各6 d.

　　1.2.3造血指标观察照射后1， 3， 5， 7， 9， 11 d以尾静脉采血，观察3组小鼠外周血白细胞、红细胞及血小板变化；照射后11 d颈椎脱臼法处死小鼠，取照射组和BMP治疗组小鼠脾脏，加入Bouin氏液固定24 h，观察标本脾结节的情况并计数。

　　统计学处理：  数据以x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，所用统计学方法为重复测量设计资料的方差分析。

　　2.结果

　　2.1rhBMP2m对放射损伤小鼠外周血白细胞的影响3组间外周血白细胞数目随时间的变化差异有统计学意义 （P<0.01）。 与对照组相比，照射组外周血白细胞数目显著减少（P<0.01），并于第7日降至最低点，第9日开始回升；与照射组相比，BMP治疗组外周血白细胞数目显著增高（P<0.01，表1）。  表1rhBMP2m对放射损伤小鼠外周血数目的影响

　　2.2rhBMP2m对放射损伤小鼠外周血红细胞的影响3组间外周血红细胞数目随时间的变化差异无统计学意义（P>0.05）。 与对照组相比，照射组外周血红细胞数目显著减少（P<0.01）；与照射组相比，BMP治疗组外周血红细胞数目虽然增高，但差异无统计学意义（P>0.05， 表1）。

　　2.3rhBMP2m对放射损伤小鼠血小板的影响3组间外周血血小板数目随时间的变化差异有统计学意义 （P<0.01）。 与对照组相比，照射组外周血血小板数目显著减少（P<0.01）；与照射组相比，BMP治疗组外周血血小板数目显著增高（P<0.01，表1）。

　　2.4小鼠脾结节数BMP治疗组小鼠脾结节数（32.80±8.81）， 显著多于照射组小鼠脾结节数（6.00±8.81，P<0.01，图1）。 对照组小鼠因没有受到辐射损伤，所以没有脾结节。

　　3.讨论

　　BMP可诱导胚胎腹侧中胚层的发生，形成含有血细胞的"间质球". BMP信号转导通路是决定胚胎细胞向造血细胞分化的关键，经过剔除编码BMP的基因而使BMP信号转导障碍的小鼠将出现胚胎腹侧中胚层发生障碍以及造血功能障碍［4-5］。 把BMP植入成年机体的肌肉或皮下，在诱导骨的同时还诱导骨髓的形成。 在软骨形成后，血管侵入软骨，小淋巴样细胞聚集，围绕血管出现大量造血干细胞，这些干细胞增殖、分化就形成造血性骨髓，这与胚胎发生时骨髓形成的过程相仿。

　　人骨形成蛋白2（human bone marrow morphogenetic protein2，hBMP2）的cDNA全长1188 bp，编码396个氨基酸，定位于20号染色体p21区域［6］。 其被翻译成前体蛋白后，切去氨基端的信号肽、前肽，两个hBMP2单体再经二聚化后分泌到细胞外。 hBMP2成熟肽含有114个氨基酸，其中包括7个在TGFβ家族中位置高度保守的半胱氨酸，6个半胱氨酸以3对链内二硫键形成一个半胱氨酸结［7］；成熟肽N端第1～17肽存在一个肝素结合位点［8］；前肽、成熟肽、同时包括BMP家族其它成员均含有一共同的蛋白酶酶切位点RXXR［9］。 以上结构可能和其所具有的诱骨活性，与胚胎发生、分化，神经系统及造血系统分化、发育的诱导作用有密切关系。 利用基因工程技术，获得重组人骨形成蛋白2 （rhBMP2）。

　　机体受到辐射时产生大量的自由基，引起生物大分子的损伤、DNA链断裂、染色体畸变，引起突变、诱发肿瘤、造成早衰和寿命缩短等现象；同时，造血组织对辐射敏感，机体受照后造血组织变化的严重程度和照射剂量关系密切。 电离辐射不仅可以引起骨髓血窦的损伤，也能抑制和破坏造血干细胞（hematopoietic stem cells， HSC）［10］。 HSC是产生各系血细胞的最原始细胞，是维持机体正常造血、保证损伤后重建造血的关键细胞。 骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells， BMSC）又被称为间质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC），它具有多向分化的潜能，同时能分泌多种造血生长因子和多种细胞黏附分子，对维持造血也有很重要的作用。 BMSC和细胞外基质在体内共同构成造血微环境支持并参与调节HSC及其子代细胞的静止、自我更新，干细胞的定位、增生、成熟，以及过成熟细胞的凋亡［11］。 免疫功能与造血功能密切相关，辐射能对免疫系统产生持久的影响。 受照后，机体巨噬细胞、CD3+/CD8+T细胞和自然杀伤NK细胞显著下降，且与照射剂量呈正相关，直接导致免疫调节功能的低下和紊乱，而引起感染造成机体死亡［12］。 而接受大剂量放疗后的肿瘤患者和急性放射病患者的骨髓造血抑制，引起严重感染等并发症是病人死亡的主要原因。

　　对人体多种造血细胞的检测结果表明，这些细胞在正常状态下分泌hBMP2，在正常造血组织中也可检测到hBMP2［13］，同时正常骨髓造血干细胞表面表达BMPII型受体。 将BMP2植入成年动物的肌肉或皮下，在植入局部诱导间质细胞形成骨、软骨细胞和诱生新的造血灶。［医学教育 网 搜集整理］

　　本实验中，三组间小鼠的外周血白细胞、血小板数目随时间变化的差异有统计学意义 （P<0.01），而外周血红细胞数目随时间的变化差异无统计学意义（P>0.05）。 与对照组相比，照射组外周血白细胞、红细胞、血小板计数显著下降（P<0.01），表明辐射对小鼠造血功能有损伤作用，其中粒细胞和血小板减少程度尤其明显，提示小鼠受到辐射后出现造血干细胞急剧减少；与照射组相比，BMP治疗组的外周血白细胞计数和血小板计数均显著增高 （P<0.01），外周血红细胞数目虽然增高，但差异无统计学意义（P>0.05），可能与实验动物数量偏少有关。 脾结节测定法是检测小鼠造血干细胞在脾脏定居和形成集落能力的方法。 照射后，照射组小鼠脾脏有少量脾结节形成，提示机体可能仍有少量造血干细胞存活；同时BMP治疗组小鼠脾脏有大量脾结节形成，其数目与照射组比较有非常显著的差异（P<0.01），且BMP治疗组小鼠脾结节的形态和大小存在差异，推测可能是由于不同系造血祖细胞定居于脾脏而形成的结果。 实验结果说明BMP2对辐射所致造血损伤的修复或对造血的促进作用是对全血细胞性的作用。 无论是辐射或是化疗药物所引起的造血损伤都是一种对各系造血细胞全面的损伤。 我们先前的实验曾经证实BMP促进造血损伤的作用优于GMCSF，其原因可能为GMCSF只是针对GM系列的细胞，而BMP则是对各系细胞均有促进修复、增殖的作用可能是因为BMP诱导造血因子释放，或者其本身即为造血因子。 rhBMP2通过什么样的途径诱导促进了造血的修复？这有待于进一步的研究。

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