磺胺类药物的主要作用机制是干扰细菌的叶酸代谢。叶酸是细菌生长繁殖所必需的物质，参与嘌呤、嘧啶和氨基酸的合成，对于细菌的核酸合成及蛋白质合成至关重要。细菌不能直接利用周围环境中的叶酸，必须自身合成。

细菌在二氢蝶酸合酶的作用下，将对氨基苯甲酸（PABA）、蝶啶和谷氨酸合成二氢叶酸。磺胺类药物的化学结构与PABA极为相似，能够与PABA竞争二氢蝶酸合酶。当磺胺类药物与二氢蝶酸合酶结合后，就会占据该酶的活性部位，使PABA无法正常与酶结合，从而阻碍了二氢叶酸的合成。

由于二氢叶酸合成受阻，细菌就不能进一步将二氢叶酸还原为四氢叶酸。而四氢叶酸是一碳单位的载体，在嘌呤、嘧啶核苷酸的合成过程中起着关键作用。缺乏四氢叶酸，细菌就无法合成足够的嘌呤和嘧啶，进而影响核酸的合成。同时，氨基酸的合成也会受到影响，因为一些氨基酸的合成也依赖于叶酸参与的一碳单位转移反应。

最终，细菌的生长繁殖受到抑制，因为核酸和蛋白质的合成是细菌生长、分裂和维持正常生理功能所必需的过程。由于人体可以直接从食物中摄取叶酸，不需要自身合成，所以磺胺类药物对人体细胞的叶酸代谢影响较小，能够选择性地作用于细菌，发挥抗菌作用。

这种作用机制使得磺胺类药物成为一类有效的抗菌药物，在临床上广泛应用于治疗多种细菌感染性疾病。不过，随着磺胺类药物的广泛使用，细菌也逐渐产生了耐药性，主要是通过改变二氢蝶酸合酶的结构，降低对磺胺类药物的亲和力，或者增加PABA的产生量等方式来逃避磺胺类药物的作用。