影响酶活性测定的因素有很多，主要包括以下几个方面。

首先是底物浓度。在酶促反应中，底物浓度对反应速度有重要影响。当底物浓度较低时，反应速度随底物浓度的增加而急剧上升，两者成正比关系；随着底物浓度的进一步增加，反应速度不再呈正比例增加，反应速度的增加幅度不断下降；当底物浓度达到一定程度后，反应速度达到最大值，此时再增加底物浓度，反应速度也不再增加，这是因为酶已被底物饱和。

温度也是一个关键因素。酶是生物催化剂，温度对酶促反应速度有双重影响。在一定范围内，随着温度升高，酶促反应速度加快，这是因为温度升高使分子运动加快，酶与底物的碰撞机会增加。但温度过高会使酶蛋白变性，导致酶活性丧失，反应速度下降。每种酶都有其最适温度，在最适温度下酶活性最高，反应速度最快。

pH值同样会影响酶活性。酶分子中的许多极性基团在不同的pH值条件下解离状态不同，酶活性中心的某些必需基团需要在某一解离状态下才容易和底物结合并具有最大的催化活性。此外，许多具有可解离基团的底物和辅酶的荷电状态也会受pH值影响，从而影响酶对它们的亲和力。而且，过高或过低的pH值都会影响酶蛋白的稳定性，使酶变性失活。每种酶都有其最适pH值，偏离最适pH值，酶活性就会降低。

抑制剂能降低酶的催化活性甚至使酶失活。抑制剂分为可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂。可逆性抑制剂与酶非共价结合，通过与底物竞争结合酶的活性中心或与酶-底物复合物结合等方式抑制酶活性，其抑制作用可以通过透析等方法去除抑制剂而恢复。不可逆性抑制剂则与酶的活性中心或活性中心外的必需基团以共价键结合，使酶失活，不能用透析等方法去除抑制剂而恢复酶活性。

激活剂可以提高酶的活性。有些酶在没有激活剂存在时只有很低的活性甚至没有活性，加入激活剂后酶活性显著提高。激活剂包括无机离子，如镁离子、氯离子等，以及小分子有机化合物等。

此外，样品的存放时间和条件也会影响酶活性测定。长时间存放或存放条件