单核细胞分离是临床免疫学和免疫检验中的重要操作，有诸多要点需要关注。

首先是样本采集与处理。样本一般为外周血，采集时要严格遵循无菌操作原则，防止微生物污染影响单核细胞的活性和后续分离效果。采集后应尽快进行处理，因为血液放置时间过长会导致细胞代谢变化，影响单核细胞的生物学特性。通常会加入适量的抗凝剂，如肝素或EDTA，以防止血液凝固，但要注意抗凝剂的浓度，过高或过低都可能对细胞产生不良影响。

密度梯度离心法是常用的单核细胞分离方法，其要点在于选择合适的分离液。常用的如Ficoll - Hypaque分离液，其密度一般为1.077±0.001g/ml，能较好地将单核细胞与其他血细胞分离开来。在加样时要小心操作，将稀释后的血液沿管壁缓慢叠加在分离液上，形成清晰的界面，避免混合，否则会影响分离效果。离心过程中，要控制好离心速度和时间。一般以2000r/min离心20 - 30分钟，离心速度过快或时间过长可能会导致细胞损伤，过慢或时间过短则无法有效分离。

分离得到的单核细胞还需要进行纯度和活性的鉴定。纯度鉴定可通过形态学观察，在显微镜下根据单核细胞的形态特征进行识别和计数；也可以采用流式细胞术，利用特异性抗体标记单核细胞表面抗原，准确测定其纯度。活性鉴定常用台盼蓝染色法，活细胞能够排斥台盼蓝而不着色，死细胞则被染成蓝色，通过计数活细胞和死细胞的比例来评估细胞活性。

此外，分离后的单核细胞需要妥善保存和培养。如果不立即使用，可将其置于合适的培养液中，在适宜的温度（一般为37℃）、气体环境（含5% CO₂）下培养，以维持其活性和功能。同时，要注意培养液的成分和pH值，确保其符合单核细胞的生长需求。

总之，单核细胞分离是一个复杂的过程，每一个环节都需要严格把控，以获得高纯度、高活性的单核细胞，为后续的实验和研究提供可靠的基础。