甾体激素C3-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合形成黄色异烟腙，在一定波长下具有最大吸收。

　　某些具有两个酮基的甾体激素可形成双腙，如黄体酮、可的松和氢化可的松等。

　　本法主要用于甾体激素制剂的测定，如倍他米松软膏、哈西奈德软膏、倍他米松磷酸钠及其注射液等的含量测定。

　　讨论：①溶剂的选择：只用用无水乙醇和无水甲醇才能得到满意的结果，其他溶剂因受到异烟肼盐酸盐在其中溶解度的限制不能采用。

　　②酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：当酸与异烟肼试剂的摩尔比为2：1时可获得最大吸收度。

　　③水分、温度、光线和氧的影响：当溶剂中含水量增高，吸收度随之降低。温度升高，反应加速。当在具塞玻管中不致使溶剂挥发及吸收水分的情况下，光与氧不影响反应。

　　④关于反应的专属性：具有Δ4-3-酮基的甾体激素在室温不到1h即可定量医学教育|网收集整理地与酸性异烟肼反应。其他甾酮化合物需在长时间放置或加热后方可反应完全，因此在上述反应条件下，本法对Δ4-3-酮甾体具有一定的专属性。