【摘要】  探讨电针大鼠胃经穴后提取的血清对胃黏膜细胞表皮生长因子受体（epidermal growth factor recep-tor， EGFR）后信息物质磷脂酶Cγ-1（phospholipase Cγ-1，PLCγ-1）、蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）和c-myc表达的影响。方法：60只大鼠随机分为正常组、胃经组、胆经组、胃经+PD153035组和胆经+PD153035组，采用水浸束缚法制作胃黏膜损伤大鼠模型，链霉蛋白酶消化法分离胃黏膜细胞，分别用EGFR抑制剂PD153035和血清孵育胃黏膜细胞，应用酶联免疫吸附法检测PLCγ-1活性，同位素掺入法检测PKC活性，逆转录聚合酶链反应法检测c-myc的表达水平。结果：正常组大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1、PKC和c-myc有微弱表达；胃经组和胆经组大鼠胃黏膜细胞 PLCγ-1、 PKC和c-myc呈现较强表达，其中胃经组大鼠表达最强烈，两组相比，差异有统计学意义（ P <0.01）；胃经+PD153035组和胆经+PD153035组大鼠胃黏膜细胞 PLCγ-1 、PKC和c-myc的表达较弱，胃经组与胃经+PD153035组相比，差异有统计学意义（ P <0.01）。结论：电针胃经穴后提取的血清能诱导大鼠胃黏膜细胞EGFR后信息物质的活化，提示存在经脉-脏腑的特异性联系。

　　【关键词】  电针

　　胃黏膜损伤是消化系统疾病中常见的一种病理反应，目前临床和实验研究皆证实针刺对胃黏膜损伤有很好的修复作用［1， 2］，并且发现表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）与胃黏膜损伤修复密切相关，对胃黏膜的保护及其损伤的修复有很重要的作用［3］。EGFR属于跨膜受体酪氨酸蛋白激酶家族，EGFR的活化可激活IP3/Ca2+和DG/PKC双信号系统以及Fos/Jun相关的Ras/Raf/MAPK依赖途径，从而引起细胞的增殖、分化、黏附和迁移等。细胞信号转导在介导细胞的分裂和增殖过程中起着重要的作用，然而目前对针刺参与胃黏膜损伤修复的信号转导机制尚未完全明了。为了进一步探讨针刺参与胃黏膜损伤修复的信号传导途径，本实验观察电针大鼠胃经穴后提取的血清对胃黏膜细胞EGFR后信使物质表达的影响，为更深入揭示针刺作用的体液机制及其信号转导机制提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 Pronase，德国默克公司产品；Trypan blue，美国Biomedicals生物医学公司产品；AMV逆转录酶、RNasin、dNTPs、Taq DNA聚合酶、100 bp DNA ladder、二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbon-ate， DEPC）、OligDT18和琼脂糖，均为美国Pro-mega公司产品；Trizol试剂盒，美国Invitrogen公司产品；［γ-32P］ATP，北京福瑞公司产品；磷脂酶Cγ-1（phospholipase Cγ-1， PLCγ-1）免疫测定试剂盒，美国Biosource公司产品；蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）检测试剂盒，美国Upstate公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 动物分组及处理 SD大鼠60只，清洁级，体质量170～230 g，雌雄兼配，均购自湖南农业大学实 验动物中心（许可证号：20030316）。大鼠在自然光暗周期的室温环境中分组饲养，自由饮水和进食。随机分为正常组、胃经组、胆经组、胃经+PD153035组和胆经+PD153035组，每组12只。各组皆随机选4只大鼠用于提取血清，其中正常组大鼠不予造模，亦不予电针，其余四组在制作胃黏膜损伤大鼠模型后当日即予电针，并于电针7 d后即提取血清；每组的另8只大鼠不予任何处理，仅用于分离大鼠正常胃黏膜细胞。胃经组取四白、梁门、足三里三个穴位，胆经组取阳白、日月、阳陵泉三个穴位，取穴采用华兴邦动物穴位图谱并结合模拟人体经穴法［4］进行。电针刺激用G6805型电针仪，胃经组电极接同侧的足三里（负极）和梁门（正极），胆经组电极接同侧的阳陵泉（负极）和日月（正极），采用疏密波，电针频率疏波4 Hz，密波20 Hz，强度以肌肉或针柄微颤为度，电针时间30 min，1次/d，共10 d.

　　1.3 实验动物模型 采用水浸束缚法制作胃黏膜损伤大鼠模型，具体方法参见文献［5］。

　　1.4 大鼠胃黏膜细胞悬液的制备 采用链霉蛋白酶消化法分离大鼠胃黏膜细胞［6］，将分离的胃黏膜细胞用无血清的DMEM培养基悬浮，并将细胞浓度调至106/ml.

　　1.5 血清制备及处理 大鼠电针结束后即行颈动脉取血，将血移入离心管中，37 ℃下静置2 h， 2 500 r/min 离心10 min（离心半径3.5 cm），用吸管小心吸取血清，将同组血清混合，过滤除菌，EP管分装，-20 ℃冻存。实验时将胃黏膜细胞悬浮液与 10 μmol/L PD153035在37 ℃下共同孵育30 min，然后用100 ml/L稀释度的血清在37 ℃下与胃黏膜细胞共同孵育30 min后即行指标检测。

　　1.6 大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1的检测 将处理好的胃黏膜细胞用冰冷的PBS洗2次，去掉上清液，收集细胞沉淀物，在冰上将细胞沉淀物溶解于细胞抽提液A（10 mmol/L Tris，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA， 1 mmol/L NaF，20 mmol/L Na 4P2O7，2 mmol/L Na3VO4，1% Triton X-100，10% glycerol，0.1% SDS，0.5% deoxycholate，1 mmol/L PMSF）中 30 min ，每隔10 min用涡流器震动1次，然后将细胞抽提物移入超微离心管中，在4 ℃下以 13 000 r/min 速度离心10 min（离心半径2.5 cm），Lowry法测定膜蛋白含量。其余步骤参照PLCγ-1免疫测定试剂盒进行，最后在酶标仪上读取吸光度值，计算机自动拟合四参数曲线并计算样本内PLCγ-1浓度。

　　1.7 大鼠胃黏膜细胞PKC的检测 将处理好的胃黏膜细胞悬液在冰上用预冷的PBS洗2次，然后超速离心2 min，12 000 r/min（离心半径2.5 cm），倒掉上清液，留取细胞沉淀，按每1×106滴入细胞抽提液B（20 mmol/L Tris/HCl，pH7.5， 0.25%蔗糖，10 mmol/L EGTA，20 mmol/L EDTA）1 ml，用超声粉碎机粉碎，每次20 s，共5次，然后在3 300× g 离心10 min，取上清液，应用Lowry法进行蛋白定量，其余步骤参照PKC检测试剂盒进行，于闪烁仪中测放射活性，蛋白激酶C比活性单位用 nmol/（g.min） 表示。

　　1.8 大鼠胃黏膜细胞c-myc基因的检测 c-myc mRNA及内参GAPDH随机引物由Invitrogen生物技术公司合成，引物序列如下：c-myc上游，5‘-TCAAGAGGCCACAGCAAAC-3’，下游，5‘-AAAAGCTACGCTTCAGCTCG-3’；GAPDH上游，5‘-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’，下 游，5‘-AAGGCCATGCCAGTGAGCTTC-3’。抽提大鼠胃黏膜细胞总RNA后依次进行RNA鉴定及RT-PCR反应（按试剂盒说明书操作），最后取扩增液做琼脂糖凝胶电泳。待电泳完成后，取出凝胶，存入凝胶成像分析系统待分析，以目的基因与GAPDH的电泳带面积灰度值比作为该例标本的基因表达的相对数值。

　　1.9 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较若方差齐时选择LSD法，方差不齐时选择Dunnett‘s T3法进行方差分析和两两比较。

　　2 结果

　　2.1 大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1表达 胃经组大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1表达与正常组、胆经组和胃经+PD153035组比较，差异均有统计学意义（ P < 0.01）； 胆经组大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1表达与胆经+PD153035组比较，差异也有统计学意义（ P < 0.01）。 见表1.

　　2.2 大鼠胃黏膜细胞PKC表达 胃经组大鼠胃黏膜细胞PKC表达与正常组、胆经组和胃经+PD153035组比较，差异均有统计学意义（ P <0.01 ）； 胆经组大鼠胃黏膜细胞PKC表达与胆经+PD153035组比较，差异无统计学意义。见表1.

　　2.3 大鼠胃黏膜细胞c-myc基因表达 胃经组大鼠胃黏膜细胞c-myc基因表达与正常组、胆经组和胃经+PD153035组比较，差异均有统计学意义（ P < 0.01）；胆经组大鼠胃黏膜细胞c-myc基因表达与胆经+PD153035组比较，差异有统计学意义（ P <0.01）。见表1、图1.

　　表1 各组大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1、c-myc基因和PKC的表达（略）

　　Table 1 Expressions of PKC， c-myc gene and PLCγ-1 in gastric mucosal cells in 5 groups

　　**P <0.01， vs normal group；△△P <0.01， vs stomach meridian group；▲P <0.05，▲▲P <0.01， vs gallbladder meridian group.

　　图1 大鼠胃黏膜细胞c-myc基因和内参GAPDH基因PCR产物电泳图（略）

　　Figure 1 Electrophoretogram of c-myc gene and GAPDH gene RT-PCR product in gastric mucosal cells

　　M： Marker； A： Normal group； B： Stomach meridian group； C： Gallbladder meridian group； D： Stomach meridian + PD153035 group； E： Gallbladder meridian + PD153035 group.

　　3 讨论

　　胃黏膜保护是指胃黏膜长期暴露于腔内各种理化因素的广泛变化而不受损伤的一种防御机制，参与黏膜防御和黏膜损伤修复的各种因素被看成是一个相互联系相互作用的网络体系。以往临床资料表明针刺足阳明经穴能增强胃黏膜的保护作用，对胃肠疾病有很好的疗效，实验研究亦显示针刺胃经穴对胃电、胃运动、胃分泌、胃黏膜血流量等均有明显调整作用，对胃黏膜损伤有很好的修复作用，并且认为针刺对胃黏膜的保护和修复效应与胃泌素、胃动素、P物质和生长抑素等脑肠肽密切相关［7～9］。 研究表明在胃黏膜损伤修复中有EGFR的高度表达，对胃黏膜的保护及其损伤的修复有很重要的作用［10］，故EGFR及其下游信号转导通路与胃黏膜损伤修复的关系日益受到人们的关注与重视，其效应是当配体与EGFR结合可引起erbB家族成员内部二聚体受体复合物的形成，激活该受体的酪氨酸蛋白激酶，结合一个ATP分子，启动一系列级联反应，与下游含有SH2和PTB区域的信号分子（如PLCγ-1）结合，并进一步激活IP3/Ca2+和DG/PKC双信号系统以及Fos/Jun相关的Ras/Raf/MAPK依赖途径，活化的MAPK将诸如c-myc，c-jun和 c-fos 等转录因子磷酸化，然后进入核内调节基因转录，从而引起细胞的分裂增殖［11］。针刺对胃黏膜损伤修复的信号转导机制是否通过EGFR介导PLCγ-1活化并进一步激活IP3/Ca2+和DG/PKC双信号系统以及Ras信号通路目前尚未完全明了。 本实验利用电针胃经穴后提取的血清孵育大鼠胃黏膜细胞，然后观察其对细胞效应的影响，结果显示电针胃经穴后提取的血清能明显提高大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1，PKC以及c-myc的表达，经PD153035阻断EGFR后其表达皆减弱，说明电针胃经穴对胃黏膜损伤的修复过程中的确有体液机制 的参与，并且电针胃经穴后所提取的血清可能通过EGRR介导PLCγ-1活化并进一步激活IP3/Ca2+和DG/PKC双信号转导通路和Fos/Jun相关的Ras/Raf/MAPK依赖途径，从而诱导胃黏膜细胞的增殖。本研究还发现电针胆经穴后提取的血清孵育的大鼠胃黏膜细胞PLCγ-1、PKC和c-myc的表达明显弱于电针胃经穴提取的血清，但高于正常大鼠血清，说明经穴脏腑确实存在一定的特异性联系，其血清中存在的相关物质及其作用机制有待从蛋白质组学上作进一步研究。

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