1.用脱脂奶粉封闭的效果不一定比用BSA差，不过我们试过几种奶粉，有一些奶粉不太适合。推荐使用的奶粉：雀巢高钙奶粉，多力精低脂奶粉。一般国产的奶粉的颗粒比较大，不太容易溶解。

　　2.关于三名治：本人以前做时花很多时间在防止短路上，现在我做的时候根本没有剪齐，最主要的是赶气泡，这是关键的关键，其实转膜的原理是电流的单向流动，现在的好多公司的转膜装置的电极是一个平面，所以不用担心短路的。（不信的可以试试！！）

　　3.关于转膜时的温度：转膜时的温度比较重要，最好保持在10度以下，可以用冰浴（Pharmacia的转膜装置），也可以在转膜液中放入合适的事先准备的冰袋（-70度>3小时）（Bio-Rad），这样既可以降温又可以节约Buffer. 4.关于转膜电流和时间：一般转膜的电流在200mA-400mA之间时间为1小时，大片段的>50KD的可以选用350mA，小片段的可以用250mA，不过本人觉得上述电流均能很好的把大部分蛋白转过去。

　　5.关于反复标记和再标记：一张膜上可以同时标记很多抗体，但要注意，一般在两个目的蛋白相差在5KD以上的，最好先后两个抗体是不同的二抗。在两个目的片段相差小于5KD时，就需要经过处理，再标记了（Re-Blot），有些公司有再标记的现成试剂，不过比较贵，最简单的方法是：ddH2O洗5分钟，0.2MNaOH5分钟，再用ddH2O5分钟*3次，然后可以再标记了。要做多个抗体的膜\的选择，最好用PVDF或教坚固的，推荐用Amsham的Hybond-P，Hybond-Extra.本人最多在一张膜上做个10个不同的抗体。