另,我用国外引物P出的产物(条带比较淡)为模板,用国内合成的引物P的试了一次,条带比较亮,位置正确.35个循环,60度退火,条件都没有变.
请高手赐教!
感谢
引物的纯化或者引物合成的正确与否是一个因素.我们用的引物一般是经过page纯化的,如果引物合成中近3'端出现错误合成碱基也会导致pcr的效率低或者扩不出来产物.
另外还要考虑的是你的RT产物,如果RNA质量较高,反转录方法得当,所得到的RT产物的浓度,基因的丰度都会较好.没必要跟国外的单独比较亮度,这里面影响因素比较多.RT产物本身是大量基因的第一链的混合,如果浓度很低,加少了做模版PCR有时检测不到.
你用p出的产物做模版再扩得比较好,这是正常的.我们在rt-pcr实验中,在引物设计很成正确的情况下,第一次pcr 检测不到产物,用来作模板,再通过巢式pcr就可
以了.
你还需要测序鉴定,看是不是你的目标产物,顺便会知道引物合成有没有问题..
我与搂主也有一个相似的问题，以cDNA扩出来的条带比较淡(不能进行灰度值分析），以P出的产物(条带比较淡)为模板，二次扩增条带比较亮，我该怎么办。
楼上说“你用p出的产物做模版再扩得比较好,这是正常的.我们在rt-pcr实验中,在引物设计很成正确的情况下,第一次pcr 检测不到产物,用来作模板,再通过巢式pcr就可” 但是我的是半定量，需要目的基因和内标灰度值相比。
老板在催我要结果，我还一点眉目也没有呢。
十分感谢life的建议!
就是说选用巢式PCR,然后再测序吗?
现在还有一个问题,如果提高RT的效率,理论上PCR产物就会增加吗?
谢谢,
另,巢式PCR可以用第一巢的引物吗?
分成两部分,仅供参考
(1)对于楼主的问题,试验目的是需要得到PCR产物,并需要测序鉴定,因为只凭条带大小是不严谨的,有时未必是你的目标片段.引物是同样的,估计国内的合成上有点问题,比如个别碱基很成错误之类,这种现象我们也发现过,导致效率很低.这一点你可以把PCR产物连到T载体上去测,这样可以顺便看到测出来的引物序列有没有问题.
RT-PCR中高质量的RNA,可以保证你在反转录的过程中得到更多的接近全长的第一链反转录产物,从而保证了你在P长片段时候的成功率,我们在克隆基因和建全长CDNA文库的时候都很注意这一点.如果RNA质量不高,有降解,得到的更多的不是全长的第一链产物.你的第二次的pcr也可以用第一次的引物,不过不叫巢式了.
(2)hemiao626战友,第一次扩增特意增加了体系中模版的丰度,再P会好一些,不过你要是做半定量,是不适合用巢式来做.不知道你现在用的引物扩的片段是不是比较长,一般定量都要扩的片段比较短一些,另外建议你设计引物在靠近3'端,或3'UTR区域,这样也会增加你的PCR效果的,参见上面,在RT产物中,在3'端,模版链丰度更高.
具体结合自己的试验,做做看就更清楚了.
感谢life的回答，我扩的除了内标外都在300bp以内。
我想问一下的是我入股二次扩增的话，这样得出的结果还可信吗？
hemiao626 wrote:
感谢life的回答，我扩的除了内标外都在300bp以内。
我想问一下的是我入股二次扩增的话，这样得出的结果还可信吗？
所扩增片段的长短是一个影响因素,但是引物的位置也有影响的,首先是优化引物,保证特异性,再就是靠近3'端为佳,你可以再多设计对不同的引物看一看.
半定量二次扩增好像没见过,不过你可以看一下,如果二次扩增半定量没什么差异,那就没有必要,不过你如果是觉得信号弱,可以考虑用定量PCR来做.这样的结果更准确,灵敏.
我的目的基因和内标基因都是师兄做过的，引物特异性很好
只是我提出RNA反转录CDNA再扩增，条带很弱，不能做灰度分析。
最根本原因是我的RNA,CDNA质量不行，但是我的条件有限，露天没有超净台，不提出高质量的RNA,CDNA。更不可能作定量PCR,.
实验老不出结果，郁闷死了，做实验是个减肥的好方法啊。
hemiao626 wrote:
我的目的基因和内标基因都是师兄做过的，引物特异性很好
只是我提出RNA反转录CDNA再扩增，条带很弱，不能做灰度分析。
最根本原因是我的RNA,CDNA质量不行，但是我的条件有限，露天没有超净台，不提出高质量的RNA,CDNA。更不可能作定量PCR,.
RNA质量很重要,不过不需要超净台,只要你在抽提过程中按操作注意RNase的污染问题就OK了,我们抽提的保存一年多都很好.
除了建议你做定量PCR还有一条建议是你可以在抽提到中RNA后,再纯化富集出MRNA,这样你做PCR,应该可以做灰度分析了.祝试验顺利!
谢谢！
