亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。例如抗原和抗体、酶和酶抑制剂（或配体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体等之间有一种特殊的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合物。如果将复合物的一方固定在不溶性载体上，则可从溶液中专一地分离和提纯另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析能产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速，有时仅一步即可达到纯化的目的医|学教育网搜集整理。

1.亲和层析支持物的选择作为亲和层析支持物须符合以下要求：

①非特异性吸附低；

②液体通过时流速要快；

③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定；

④必须有合适的、丰富的化学基团，能有效地与蛋白质或其它化合物结合；

⑤必须带有丰富的微孔，以增加结合容量。符合以上5个条件的支持物有琼脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。

2.配体的选择 所谓配体系指具有亲和性的双方，作为免疫亲和层析专指抗原与抗体。良好的配体必须具备以下3个条件。

（1）抗原或抗体必须单一特异性：抗原或抗体的纯化效果决定于固相中配体的纯度。

（2）抗原与抗体之间必须有强的亲和力：这种亲和力决定于抗原决定簇的性质和数量。对抗体来说还决定于抗体来源动物的种类和免疫时间，如马抗血清亲和力较低，免疫血清亲和力较高；免疫时间短的亲和力低。但是，亲和力太强也不利，因为解离抗原抗体复合物所需要的条件就要强烈，从而可造成蛋白质的变性。例如用低pH（1.5～2.5）或高盐（如6mol/L盐酸胍）可使部分抗原或抗体活性降低或丧失。

（3）配体必须有一个适当的化学基团，这个基团不参与配体和大分子的特异结合，但可用来连接支持物，而且这种连接不应当影响配体与大分子结合的亲和性。

3.抗原或抗体与支持物的结合 将抗原或抗体结合到支持物上的方法目前有20多种，但可归结为载体结合法、物理吸附法、交联法和网络法4类。

结合法的一般步骤是先活化支持物上的功能基团，然后将抗原或抗体连接到这些活化的基团上。用来发生交联的化学反应必须足够温和，不致使抗原或抗体遭到破坏。交联后，要彻底清洗支持物，以除去剩下的未交联的物质。

最常用的支持物是Separose4B，将此支持物与溴化氰在pH11时进行处理，则能使支持物活化。此时溴化氰与支持物上的羟式反应形成氨基甲酸酯基团。加入溴化氰的量取决于支持物的量。如果希望取代程度提高，则加入溴化氰的量也要提高。交联时首先要注意加入抗原或抗体的浓度。通常在交联反应混合物中的交联蛋白质浓度应是亲和分离浓度的20～30倍。这样，溴化氰浓度也必须提高到200mg/ml凝胶。若希望最终产物含量较少，所加入的溴化氰也应减少。交联时的pH也应注意，pH9.5～10时，活化的琼脂糖珠很不稳定。降低pH，也就减少了能反应的配体浓度，交联量就会减少。

亲和层析中常用小分子抗原或其它化合物与支持物交联，由于载体空间的位阻而影响了与抗原或其它亲和物的结合，产生了所谓的无效吸附。另外，Sepharose4B交联时要求有一游离的氨基，如果该抗原有具氨基则难于交联。基于这两个原因，通常在琼脂糖与抗原之间接上不同长度的“手臂”。必要时这些“手臂”末端可接上游离氨基，以与不带氨基的配基偶联。常用的带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖（二亚胺）、羧基琼脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰琼脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮盐衍生物琼脂糖和疏基琼脂糖等。这些带“手臂”的琼脂糖有商品供应，使用极为方便。

4.亲和层析条件的选择

（1）支持物与抗原或抗体结合后，还可能有多余的活性基团，为了封闭这些残基团，必须用无关蛋白质或三乙醇胺过一次柱，以封闭活性基团。

（2）去掉未结合及结合不牢固的蛋白质。先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脱2～3个柱体积，再用解脱剂处理一次亲和层析柱。

（3）解脱剂有多种。常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1缓冲液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸钾（或钠）、1mol/L乙酸、6mol/L盐酸胍、0.2mol/LKC1等。作为抗原抗体解脱剂，最多用的是3mol/L硫氰酸钾（或钠）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸缓冲液。