1940年H.A.克雷伯斯提出三羧循环学说以来，柠檬酸的发酵机理逐渐被人们所认识。已经证明，糖质原料生成柠檬酸的生化过程中，由糖变成丙酮酸的过程与酒精发酵相同，亦即通过E-M途径（二磷酸己糖途径）进行酵解。然后丙酮酸进一步氧化脱羧生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A和丙酮酸羧化所生成的草酰乙酸缩合成为柠檬酸并进入三羧循环途径。

柠檬酸是代谢过程中的中间产物。在发酵过程中，当微生物体内的乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低、而柠檬酸合成酶活性很高时，才有利于柠檬酸的大量积累。