利用抗原抗体特异结合的特性，用免疫测定技术定量或定性检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，但只要获得了针对某一细胞因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体），即可采用免疫测定法进行检测。常用的方法包括ELISA、RIA、免疫印迹法、免疫荧光法以及基于免疫荧光技术的流式细胞仪分析法。

一、ELISA方法

ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。双抗体夹心法是用于细胞因子测定的最常用方法，该法使用的抗体可以是针对同一抗原的多克隆抗体，也可以是针对同一抗原的不同抗原表位的单克隆抗体。

细胞因子测定的标本主要包括两大类，一是血清（血浆）、关节液、胸腔液、脑脊液或腹腔液等体液，可用于细胞因子和可溶性黏附分子的检测；二是细胞体外培养后的培养上清液，只用于细胞因子的检测。

ELISA法具有特异、简便、易于推广和标准化等优点，可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理，成为细胞因子测定的首选方法。此外，无生物学活性的细胞因子前体、分解片段以及与相应受体的结合物也可用此法检测。其缺点是敏感性偏低、不能判断细胞因子的生物学活性。

二、流式细胞分析法

流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或黏附因子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。根据荧光抗体的性质，荧光抗体染色分直接法和间接法，前者使用荧光标记的细胞因子或黏附分子的特异性抗体，后者则用荧光标记二抗。直接法较为常用，其敏感性虽不及间接法，但特异性强。

该法检测细胞内细胞因子时，主要包括以下基本步骤：

1.分离和培养待检细胞

2.细胞固定 常用的细胞固定剂为4%多聚甲醛。

3.封闭非特异性结合位点 即用含5%脱脂奶粉和钙、镁离子的PBS溶液，重悬已固定的细胞。

4.染色与分析 即用荧光素标记的细胞因子特异性单克隆抗体做荧光抗体染色，用流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分比和荧光强度。此外，若应用不同荧光素标记两种以上细胞因子的单克隆抗体，则可同时检测同一细胞内2种以上不同的细胞因子。

应用此法还可区分具有不同分泌特性的细胞亚群，如Th1、Th2细胞等。

三、酶联免疫斑点试验

酶联免疫斑点试验（ELISPOT），源自ELISA，但又突破传统ELISA，是定量测定抗体形成细胞技术的延伸和发展，已被愈来愈多地应用于类风湿因子、IFN-γ等细胞因子分泌细胞的定量测定。

ELISPOT优于传统抗体、细胞因子或其他可溶性分子分泌细胞的检测方法，能从20万～30万个细胞中检测出1个分泌相应分子的细胞，若引人生物素与亲和素系统，敏感性还将大大提高。在作ELISPOT时，选择的特异性抗体应该具有高亲和力、高特异性、低内毒素的特性。选用的细胞激活物必须不影响细胞的分泌功能。

四、免疫学测定方法学评价

免疫测定法几乎可以用于所有细胞因子的检测，与生物活性测定法相比，其主要优缺点分别是：

优点：①特异性高，使用特异的单克隆抗体，可用于单一细胞因子的检测；②操作简便、快速，无需依赖细胞株，故不需维持培养，使方法的可操作性大大增加，容易推广和便于普查；③影响因素相对较少且容易控制，重复性好，方法容易标准化。

缺点：①所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定成正比；②测定结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系，使用不同来源亲和力的单抗，对同一标本测到的结果可能不同；③敏感性相对较低，比生物活性法约低10～100倍，测定下限一般为100pg；④若标本中存在细胞因子的可溶性受体，可能会影响特异性抗体对细胞因子的结合。

除上述介绍的方法外，同属生物学测定方法的分子生物学技术，在细胞因子或黏附分子检测方面应用也十分广泛，诸如PCR/RT-PCR、斑点杂交、Northern-blot，以及包括FISH在内的细胞或组织原位杂交等。

其他免疫测定法：偏振荧光检测技术；激光共聚焦显微镜的使用；发光技术；免疫组化染色。所有这些方法都在黏附分子、细胞因子及其分泌细胞的检测方面发挥了积极的作用。

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