【关键词】  子宫内膜异位症；NF

　　Expressions and correlation of nuclear factorkappaB and vascular endothelial growth factor in endometriosis

　　WANG Fang， HE YuanLi， ZHAO RuZhu， LIU MuBiao， PENG DongXian

　　Department of Gynecology and Obstetrics， Lanzhou General Hospital， Lanzhou Military Area Command， Lanzhou 730050， China，  Department of Gynecology and Obstetrics， Zhujiang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou  510282， China

　　【Abstract】AIM： To investigate the expressions of nuclear factorkappaB（NFκB） and vascular endothelial growth factor（VEGF） proteins in endometriosis（EM）， and to evaluate the correlation between NFκB and VEGF expressions. METHODS：  Immunohistochemistry was used to examine the NFκB and VEGF protein expression in 35 specimens of normal endometrium，48 of eutopic endometrium of endometriosis and 76 of ectopic endometrium， and the results were analyzed with SPSS11.0 statistical software. RESULTS： The expressions of NFκB and VEGF were mainly found  in the glandular epithelial cells of the 3 kinds of endometrium， with the ectopic endometriotic tissues showing the highest and the normal endometrium showing the lowest expression （P<0.05）。 Both NFκB and VEGF expressions in proliferative phase were significantly lower than those in secretory phase of normal and ectopic endometria （P<0.05）。 Furthermore， the expressions of NFκB and VEGF proteins were positively correlated in normal endometria， eutopic and  ectopic endometria （rs=0.660， 0.733 and 0.827， respectively， P<0.01）。 CONCLUSION： NFκB and VEGF proteins are highly expressed and show a positive correlation in EM， which suggests that they may participate in the pathogenesis of  EM.

　　【Keywords】 endometriosis；  NFkappaB； vascular endothelial growth factors；  immunohistochemistry

　　【摘要】目的：检测核转录因子（NFκB）及血管内皮生长因子（VEGF）在子宫内膜异位症（EM）中的表达，探讨其与EM发病机制的相关性。 方法： 采用免疫组化SP法分别检测NFκB及VEGF在35例正常子宫内膜、48例EM在位内膜及76例EM异位内膜中的表达，并对检测结果进行统计学分析。 结果： NFκB和VEGF主要定位于3 组内膜腺上皮细胞的胞质中，其中异位内膜表达强度最强，正常子宫内膜的表达强度最弱（P<0.05）。 在位内膜和正常子宫内膜NFκB和VEGF的表达强度随月经周期发生一定的变化，分泌期高于增殖期，差异有统计学意义（P<0.05）。 NFκB与VEGF之间在正常子宫内膜、异位内膜和在位内膜中的表达具有正相关性，相关系数分别为0.660，0.733和0.827 （P<0.01）。 结论： NFκB和VEGF在EM患者的在位及异位内膜的高表达及二者之间的正相关性提示其在EM发病机制中起一定的作用。

　　【关键词】 子宫内膜异位症；NFκB；血管内皮生长因子类；免疫组织化学

　　0引言

　　子宫内膜异位症（ endometriosis， EM）是一种生育期妇女常见的良性疾患，但异位的子宫内膜却具有类似于恶性肿瘤转移、种植、侵袭等生物学特性，而此过程均依赖于新生血管的形成。 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是为单一基因编码的同源二聚体糖蛋白，是最为关键性的血管形成刺激因子。 它可直接而特异作用于血管内皮细胞，导致新生血管形成。 NFκB（nuclear factorkappaB）是一种重要的基因转录调控因子，参与细胞因子、黏附分子、血管活性调节因子的调节，研究证实NFκB对于VEGF的调控与多种恶性肿瘤新生血管的生成有关［1］。 本文采用免疫组织化学的方法检测NFκB和VEGF在正常子宫内膜和EM患者的在位及异位内膜中表达情况，以探讨NFκB和VEGF与EM发病的相关性。

　　1对象和方法

　　1.1对象选择199801/200212南方医科大学附属南方医院及珠江医院病理科保存的76例EM异位内膜和48例EM在位内膜（增生期28例，分泌期20例）的标本作为研究对象。 选择同期经腹腔镜确诊35例单纯输卵管性不孕症的患者正常子宫内膜标本作为对照组，其中增生期20例，分泌期15例。 研究组和对照组的年龄无统计学差异，月经周期规则，除去其他内外科疾病，术前3 mo无甾体类激素治疗史。

　　1.2方法标本经40 g/L 甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，分别做VEGF和NFκB免疫组化标记（兔抗人NFκB多克隆抗体购自北京中山生物公司，即用型工作液，鼠抗人VEGF单克隆抗体购自福建迈新生物公司，工作浓度为1∶50）；采用SP法，按试剂盒说明书步骤进行。 经DAB显色后，苏木素复染，中性树胶封固。 用已知的阳性片作为阳性对照，每组均用PBS代替一抗作阴性对照。

　　结果判断以细胞胞质中出现棕黄色颗粒为判断标准，按FDA推荐的染色强度分级： ① 阴性（-）： 细胞无着色或阳性细胞数<5%； ② 弱阳性（+） ：细胞轻度着色呈淡黄色，阳性细胞数5%～25%； ③ 阳性（） ：细胞着色呈深黄色，阳性细胞数25%～50%；④ 强阳性（）：细胞明显着色，呈棕黄色，阳性细胞数>50%.结果判断在双盲下进行，每张切片由两名病理科医生分别计数。

　　统计学处理：   应用SPSS11.0 统计软件对资料进行KruskalWallis 秩和检验和Spearman秩相关分析。

　　2结果

　　2.13组内膜NFκB和VEGF的表达NFκB和VEGF主要表达于3组内膜的腺上皮细胞，在异位内膜和在位内膜的间质及血管内皮细胞中亦有表达。 3组子宫内膜NFκB和VEGF表达强度有统计学差异，对照组表达最弱，异位内膜组表达最强（P<0.05）；NFκB和VEGF的表达在对照组增殖期内膜和分泌期内膜比较，差异有统计学意义（P<0.05）；在位子宫内膜增殖期和分泌期均有NFκB和VEGF表达，增殖期表达强度低于分泌期（P<0.05）；（表1，图1~2）。

　　表1NFκB和VEGF在EM患者异位、在位内膜及正常子宫内膜中的表达（略）

　　A： 分泌期正常子宫内膜的阳性表达SP ×200； B： 增殖期在位内膜阳性表达SP ×200； C： 子宫腺肌病的阳性表达SP  ×200； D： 卵巢子宫内膜异位症的阳性表达SP ×200.

　　图1VEGF在组织中的表达（略）

　　2.2NFκB和VEGF在对照组子宫内膜、异位内膜和在位内膜中表达的相关性3组内膜中NFκB与VEGF表达的相关系数分别为rs=0.660（P<0.01）， rs =0.733（P<0.01）， rs=0.827（P<0.01），说明两种因子表达呈正相关。

　　A： 增殖期正常子宫内膜的阴性表达SP ×200；B：分泌期在位子宫内膜阳性表达SP ×200；C：子宫腺肌病的阳性表达SP ×200；D：卵巢子宫异位内膜及间质的阳性表达SP ×100.

　　图2NFκB在组织中的表达（略）

　　3讨论

　　EM真正的病因及发病机制至今未明。 目前Sampson经血逆流种植学说［12］为大家所接受，然而已知多数妇女经期均有经血逆流现象，却仅10%左右发病，因此，经血逆流可能只是EM发病的基础，而近来研究表明EM患者的内膜具有转移、种植、生长等类似恶性肿瘤细胞生物学行为的能力可能才是EM发病的关键［3］。 目前研究证实，恶性肿瘤的转移、种植及生长均依赖于新生血管的形成，而脱落的子宫内膜附着于腹膜或其他部位时，异位的子宫内膜及其周围组织新的血供的建立与维持，亦是子宫内膜异位种植存活和内异症发生的基本条件。

　　VEGF是一种多肽类细胞因子。 体外实验中VEGF 可刺激血管内皮细胞增殖，诱导其迁移和形成管腔样结构，在体内实验中，它可直接诱导新生血管形成。 并且VEGF 还可能增加微血管通透性，通过引起血浆蛋白的高度通透性而诱导间质产生，易于血管的生长。 本实验结果发现EM 患者的异位内膜和在位内膜的VEGF 均主要表达于腺上皮及间质且强度高于对照组， 说明异位内膜和在位内膜可能具有组织同源性，即逆流经血中的子宫内膜高水平表达VEGF，使之易于在盆腔腹膜表面种植。 而且在位内膜的VEGF在分泌期腺上皮中的染色强度均明显增高，提示此阶段的子宫内膜更易于种植。 由此可见，VEGF 在EM 的发病机制中有重要作用， EM 的发生有赖于血管的增生。 VEGF 含量的增高与子宫内膜血管生成增多可能是EM 中异位内膜成功种植与生长的决定因素。

　　NFκB是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族，它作为信号传导途径中的枢纽，参与炎症、免疫、肿瘤的发生和发展、细胞凋亡的调节以及胚胎的发育等多种生理、病理过程的基因调控，是一种关键性的核转录因子。 已有的研究表明，NFκB 在肿瘤新生血管形成的调控中发挥重要的作用，它的表达上调可以使多种与肿瘤新生血管形成过程起重要作用的细胞因子，如IL8，肿瘤相关黏附因子（VCAM1， ICAM1，ELAM1）、肿瘤坏死因子（TNF）及血管内皮生长因子（VEGF）［4-5］等的表达增强，而上述的细胞因子已被证实与EM的发病密切相关［6-7］。 我们实验结果提示NFκB在三组内膜中表达强度不同，异位内膜和在位内膜高于对照组子宫内膜，提示异位内膜细胞中NFκB的激活与EM的发病相关；NFκB与VEGF均主要表达于腺上皮细胞的胞浆中，异位内膜的间质及血管内皮细胞亦有表达，但正常子宫内膜间质及血管NFκB表达为阴性，提示EM患者NFκB的激活可能使VEGF过度表达，从而促进异位内膜新生血管形成；NFκB与VEGF在EM患者异位和在位内膜表达的正相关性，提示NFκB的表达增强可能上调VEGF的表达强度，从而使逆流的内膜易于种植，且种植后具有类似恶性肿瘤的侵袭性与转移性。 由此设想，在EM发病过程中，NFκB可能对VEGF以及其他与新生血管形成相关的细胞因子起到中枢性的调控作用，而且我们研究也可能为抗血管治疗EM提供新思路和方案。

　　【参考文献】

　　［1］ Kiriakidis S， Andreakos E， Monaco C， et al. VEGF expression in human macrophages is NFkappaBdependent： Studies using adenoviruses expressing the endogenous NFkappaB inhibitor IkappaBalpha and a kinasedefective form of the IkappaB kinase 2［J］。  J Cell Sci， 2003，116（Pt4）：665-674.

　　［2］ Sampson J. Peritoneal eudometriosis due to meutal dissemination of endometvial tissue into the peritoneal cavity ［J］。 Am J Obstet Gynecol， 1927，14：422-469.

　　［3］ Mclaren J， Prentice A， CharnockJones DS， et al.Vascular endothelial growth factor concentrations are elevated in peritoneal fluid of women with endometriosis［J］。 Hum Reprod， 1996，11（1）：220-223.

　　［4］ Son EW， Mo SJ， Rhee DK， et al. Vitamin C blocks TNFalphainduced NFkappaB activation and ICAM1 expression in human neuroblastoma cells［J］。 Arch Pharm Res， 2004，27（10）：1073-1079.

　　［5］ Sakamoto Y，  Harada T，  Horie S， et al. Tumor necrosis factoralphainduced interleukin8 （IL8） expression in endometriotic stromal cells， probably through nuclear factorkappa B activation： Gonadotropinreleasing hormone agonist treatment reduced IL8 expression［J］。 J Clin Endocrinol Metab， 2003，88（2）：730-735.

　　［6］ Darai E， Detchev R， Hugol D， et al. Serum and cyst fluid levels of interleukin （IL）6， IL8 and tumour necrosis factoralpha in women with endometriomas and benign and malignant cystic ovarian tumours［J］ .Hum Reprod， 2003，18（8）：1681-1685.

　　［7］ Wu MY， Ho HN. The role of cytokines in endometriosis［J］。 Am J Reprod Immunol， 2003，49（5）：285-296.