血小板糖蛋白Ⅱb-Ⅲa受体拮抗剂
3.2 伊替非特：伊替非特(tirofiban)的临床开发应用源于对GPⅡb-Ⅲa抑制剂的需求,即它必须是特异地针对GPⅡb-Ⅲa的,具有可逆的抗血小板作用又不产生抗体反应。其发展的第一步是源于东南方小响尾蛇毒液中的73氨基酸肽的发现Sistrutusm,barbouri。Barbourin是disintegrin家族成员之一,是一种蛇毒多肽,特点为能通过粘合整联蛋白,阻止其在正常生理过过程中的活性。迄今认为,在disintegrins成员中,barbourin独具对GPⅡb-Ⅲa的特异性和高度亲和性 医学教 育网收集整理 。其他disintegrins与GPⅡb-Ⅲa和有关整联蛋白的粘合是以RGD(精酸－甘氨酸－天冬氨酸)序列为媒介的RGD序列也存在于生理配体,而barbourin的、GPⅡb-Ⅲa特异性是由赖氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(KGD)序列所赋与的。赖氨酸取代精氨酸被证实为barbourin对GPⅡb-Ⅲa特异性的唯一决定因素,barbourin的临床方面发展受阻于其线性结构,此结构使它易被血浆蛋白酶快速降解,同时由于它具有抗原性。
以barbourin作为结构模板合成的环状七肽的伊替非特(分子量832道尔顿)保持了对GPⅡb-Ⅲa的特异性和亲和力。伊替非特的环状结构能对抗血浆蛋白酶,但它的分子量小从而使诱导抗体应答的能力降低。伊替非特通过KGD序列的修饰保持了barbourin对GPⅡb-Ⅲa的特异性与亲和力,其通过KGD序列与GPⅡb-Ⅲa的相互作用,需要Ca2+和一个完整受体结构的存在,这样就与生理性的配体结合机制十分接近。医学教育网
虽然伊替非特与GPⅡb-Ⅲa的亲和力较高,但仍不如阿昔单抗,因此,循环中的大多数伊替非特分子未与血小板结合,停药后血小板功能又会很快恢复,伊替非特的这种可逆性,使治疗后发生出血性并发症的危险降低,且停药后短时间内即可安全施行CABG手术。
伊替非特主要经肾脏清除,有肾功能损害的病人,其血药浓度会有所增加,致使其抗血小板功能的可逆性降低,这些病人潜在出血危险性,可通过输入血小板而降低,但这会使有效的血小板GPⅡb-Ⅲa受体池增加,使抑制血小板聚集的程度显著降低。对于轻度肾功能不全(血肌酐2.0～4.0mg/dL)的病人,通过降低输入剂量(从2.0ug/kg/min降至1.0ug/kg/min)会有所帮助。
3.3 替罗非班：非肽类似物替罗非班的临床开发与伊替非特的开发相似。替罗非班是一种非抗原性小分子(分子量495道尔顿),具有对GPⅡb-Ⅲa的高亲和力和特异性,同样,对血小板的抑制作用在停药后很快逆转。它从血浆中被清除也主要通过肾脏,对肾功能严重受损者(肌酐清除率＜30ml/min)需减小输注剂量。对严重肾功能不全出血危险增加者,可通过输血小板来降低出血危险。
4．GPⅡb-Ⅲa拮抗剂药代动力学
开发GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的关键之一是找到一种体外试验,它能准确反映这些药物在体内的实际生理作用状况。
标准出血时间延长作为一种广泛用于评价其他抗血栓剂的方法,已被采用为密切反应临床出血事件可能性的指标,然而对阿昔单抗前体7E3研究表明,发生临床出血事件病人的出血时间与其实际出血并不相平行。另外,一个包括3300病的18个试验的荟萃分析也表明出血时间预测值不可靠,因此这个指标对GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的开发无关紧要。医学教育网
血小板GPⅡb-Ⅲa受体占据率可能成为定量评价GPⅡb-Ⅲa拮抗剂粘合的有用方法。这种方法始创于阿昔单抗试验中,修改后用于伊替非特研究中。这种方法对GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的药代动力学研究有重要补充作用,然而因为它不能检测这些药物在血小板聚集中的抑制作用,且对各种GPⅡb-Ⅲa拮抗剂确定受体占据率的技术要求不同,使其相互比较有困难。
检测GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的最普遍被接受的化验是体外血小板聚集浊度测定法,这种检验包含试管中血样本的采集、防止凝集、富含血小板血浆(PRP)标本的准备和激动剂对血小板聚集的刺激。血小板聚集沉淀于试管底部以易于检测通过血浆传输的少量的血小板的增加。现存的抑制血小板聚集的制剂,例如GPⅡb-Ⅲa拮抗剂,使增加的少量传输血小板减少(或消失),其减少程度与血小板聚集抑制水平成比例。
对于一种阿昔单抗(m7E3 F[ab']2)前体的早期动物研究显示：在犬深动脉损伤的模型中,防止血栓闭塞至少需要体外血小板聚集抑制80%。初步的临床研究也提示不良的缺血结果通常发生在血小板聚集抑制＜80%的病人。虽然血小板聚集抑制＞80%的阈值在目前的临床研究中得到普遍认可,其最适的抑制程度和GPⅡb-Ⅲa受体用于并有益于各种临床事件(PCI,ACS)的情况仍需要严谨地说明。
对所有3种制剂的药代动力学进行研究以寻找迅速达到并保持血小板聚集抑制=80%的靶剂量。然而,这些研究应用了不同的抗凝剂和不同浓度的ADP激动剂使结果难以直接比较。而且,最近的研究显示体外血小板聚集测定的结果显然受抗凝剂的选择和所用激动剂的浓度的影响。 医学教 育网收集整理
4.1 抗凝剂的影响 用于体外血小板聚集测定时抗凝剂明显影响GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的抗血小板效果,这一最初的观察是在评价GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的一种肽TP9201的研究中得到的。血浆以肝素抗凝时TP9201抑制50%(IC50)人血小板聚集所需浓度比以柠檬酸钠抗凝所需浓度多10倍。不像肝素那样,柠檬酸与钙离子结合使其血浆浓度从生理水平的1mmol减少到40-50μmol。柠檬酸的存在可增加TP9201的结合,即提示某些GPⅡb-Ⅲa配体如TP9201可与钙离子竞争与GPⅡb-Ⅲa结合。
最近Phillips等证实eptifibatide也有类似发现。在无钙离子螯和剂的抗凝剂时伊替非特的IC50作用4倍于柠檬酸存在时。而且,GPⅡb-Ⅲa与纤维蛋白原结合的IC50在钙离子生理浓度时也明显增高。在这些研究的基础上,对于人选PCI的病人进行了伊替非特的药代动力学研究。PRIDE(Integrilin血小板聚集和受体应用的动力学评价)研究,旨在探讨以PPACK或柠檬酸作为血浆抗凝剂时不同剂量伊替非特对20μmol ADP诱导的血小板聚集的抑制效果均减低。这项研究引起对非ST段抬高的ACS病人进行伊替非特剂量选择以达到PPACK为抗凝剂的体外血小板聚集抑制≥80％的大规模试验Ⅲ。其中的一种方案(180ug/Kg弹丸注射加2.0ug/min注射)已得美国食品和药物管理局批准用于这些病人。
在麻省综合医院实验室对PCI病人的研究显示较高剂量(180ug/Kg弹丸注射,之后立即以2.0ug/Kg/min注射,10分钟后在给予180ug/Kg弹丸注射［180/2.0/180］)伊替非特可在介入治疗后1-4小时持续有力(大于90％)地抑制血小板聚集,检测方法以PPACK为抗凝剂、以ADP为激动剂。支架置入PCI后,这种剂量的伊替非特显示可有力而显著地减少至少30天内临床事件的发生率(ESPRIT试验)。
目前,阿昔单抗和tirofiban的药代动力学评价仅限于在柠檬酸抗凝剂的标本中进行,亦没有有关其它抗凝剂与GPⅡb-Ⅲa相互作用的报道。这些情况引起对阿昔单抗和tirofiban在存在PPACK或柠檬酸的体内抗血小板效果的再评价,激动剂为20μmol ADP。同一情况下eptifibatide的早期发现提示：阿昔单抗和tirofiban的IC50值在PPACK为抗凝剂组明显高于柠檬酸为抗凝剂组。抗凝剂对IC80的影响也很明显,考虑到阿昔单抗和替非罗班的批准剂量是应有和柠檬酸的体外研究,可能体内浓度并不能持续提供大 于80％的血小板聚集的抑制。
Kereiakes等最近的报道比较了30例(每组10例)UA接受PCI病人阿昔单抗、伊替非特和替罗非班的药代动力学效应。Turbidimetric小量传输血小板聚集的测定一PPACK为 抗凝剂,以20μmol ADP为激动剂,应用阿昔单抗注射12小时,而eptifibatide和tirofiban注射19小时。接受18小时静脉注射tirofiban的9例病人(1例因血小板减少而停药),替罗非班的血小板聚集抑制的中位数除注射终点外(18小时)各时间点均≤80％(40分钟,2小时和6小时)。这个观察与最近报道的以柠檬酸钠为抗凝剂和以5μmol ADP为激动剂的应用tirofiban认可剂量对血小板功能研究的结果相符。相反,阿昔单抗和eptifibatide的中位抑制作用在治疗期间均超过80％。有趣的是,阿昔单抗的血小板抑制是变化的,抑制水平≤80％在40分钟时有2个病人,2小时有3个病人,6小时有4个病人,注射终点时有5个病人。Eptifibatide抑制≤80％的病人数分别为1、2、1和0个。快速血小板功能测定的报告与以上结果相似。
综上所述,这些发现提示在生理浓度的钙离子(－1mmol)条件下,伊替非特认可剂量是可达到＞80％血小板聚集抑制的靶目标。值得注意的是,停药后血小板功能的恢复eptifibatide和triofiban均快于阿昔单抗,与早期药代动力学研究和这些制剂与GPⅡb-Ⅲa有较低亲和性的结果一致。
4.2 激动剂的影响
GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的抗血小板效果亦受激动血小板的激动剂的选择及其浓度的影响。如前所述,临床试验中对体外血小板聚集的测定剂量选择方案为5μmol ADP(tirofiban)和20μmol ADP(阿昔单抗、伊替非特)。阿昔单抗试验显示存在高浓度ADP(20μmol)时其抑制效果不显著。另外,在柠檬酸血浆中的tirofiban的IC50大于存在高浓度ADP时(20μmol ADP时87nmol,10μmol ADP时35.7nmol,3.36μmol ADP时20.0nmol)。如前所述,以20μmol ADP激活并以PPACK抗凝的标本中tirofiban的IC50亦较高(220nmol)。应用较高浓度ADP的阿昔单抗和伊替非特的研究提示：对这两种药物的抗血小板作用的估计比tirofiban更保守,尤其考虑到抗凝剂的效应时。
体内血小板聚集可由除ADP外的凝血酶、胶原蛋白、肾上腺素和5-羟色胺等其他激动剂介导,生理情况下作用最强的可能是凝血酶。由于制备困难和凝血酶的促凝作用,排除了广泛应用凝血酶进行体外血小板聚集的测定。对凝血酶的主要血小板受体(即蛋白水解酶激活受体［PAR］－1)的克隆和发现减低了两种分子间相互作用的机制。这种认识引起凝血酶受体激动剂肽(TRAPs)的合成,小分子(6-14氨基酸)IRAPs仿制凝血酶及其特性并通过与PAR－1受体相互作用刺激血小板聚集。不象凝血酶那样,TRAPs不使纤维蛋白原凝结且易于制备,因此用于体外血小板聚集的测定。
与ADP比,TRAPs(和凝血酶)是更强的血小板激动剂,它不仅可激活已在血小板表面表达的GPⅡb-Ⅲa,而且促进GPⅡb-Ⅲa在血浆a颗粒膜细胞间的转移。因此,用TRAP为激动剂时,达到血小板聚集抑制水平的GPⅡb-Ⅲa抑制剂的用量较低则不足为奇。例如,阿昔单抗弹丸注射2小时后,柠檬酸钠抗凝的标本的血小板聚集抑制以7.5μmol TRAP为激动剂时为53％,以20μmol ADP为激动剂时为73％。同样,不管抗凝剂是柠檬酸钠还是PPACK,以5μmol TRAP诱导血小板聚集时eptifibatide的IC50比20μmol ADP诱导时高。为了更广泛地评价激动剂的效果,5μmol TRAP或20μmol ADP为激动剂的条件下对各种GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的抑制效果进行了研究。正如所料,不管抗凝剂是PPACK还是柠檬酸钠,激动剂为TRAP时所有三 种GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的IC50均较高。综上所述,这些发现提示以PPACK为抗凝剂(或另一种生理性血浆浓度的钙离子)和以TRAP激活血小板的测定是对体内GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的抗血小板效果的最保守的估计。应该说明的是TRAP诱导的血小板聚集抑制的水平是否有显著的治疗效果尚不清楚,这个问题的说明需要更多的研究。
5．总结
GPⅡb-Ⅲa拮抗剂一种新的强有力的抗血小板制剂,最近用于非ST段抬高的ACS病人的治疗(伊替非和持,替罗非班)和接受PCI治疗的病人(阿昔单抗和伊替非特)。这些制剂在主要临床试验中的应用剂量和现在选择的所用批准剂量是以体外抗血小板聚集对激动剂的反映能力抑制≥80％为基础的,以往对这些药物的药代动力学研究选用了不同的抗凝剂和激动剂浓度使得对这些药物的比较相对困难,最近的资料显示：抗凝剂和激动剂强度的选择有明显体外的影响。这些数据说明：在生理浓度钙离子条件下的抗凝剂(例如,PPADKvs柠檬酸钠)和较高浓度激动剂(20μmol ADP vs 5μmol ADP)时,所有三种制剂的抑制效果较低。这些观察提示：标准测定时,批准剂量的阿昔单抗和替罗非班的体内血小板聚集抑制少于80％的靶目标。对应用批准剂量的GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的PCI病人,在标准状况下测定(PPACK为抗凝剂,以20μmol ADP激活血小板)的结果说明伊替非特比阿昔单抗提供更持续的≥80％的血小板聚集抑制。相反,目前批准的替罗非班的剂量在多数注射期间不能达到80％的血小板聚集抑制,为了比较各种GPⅡb-Ⅲa拮抗剂的抗血小板效果,应进行标准状况下的体外研究。另外,确定获得临床益处的血小板激动剂诱导的血小板聚集抑制的程度是很重要的。
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