本人近其做Siminar,读的文章题目是“Differential Antigen Processing by Dendritic Cell subsets in Vivo" 原文见于Science 2007, 315: 107-111。现将翻译稿件录如下，希望对大家有帮助。体内树突状细胞亚型加工(processing)
分化抗原（differential antigen）的过程
Abstract: DC加工并提呈自身与外来抗原诱导免疫耐受或发生免疫反应。体外研究提示对抗原提呈的调节控制了免疫反应，但体内DC如何控制抗原提呈却了解不多。为了解抗原在体内加工与提呈过程，我们使用嵌合的单克隆抗体（Chimeric）特异地将不同靶抗原给予DC的两种主要亚型。CD8+DC表达膜表面分子CD205，与之不同的是， CD8- DC 表达33D1抗原分子，能特异地结合MHC-II分子并被提呈。不同DC亚型加工抗原的不同是本质上的区别，参与MHC处理过程中的蛋白表达量的增加与之有关。
淋巴器官中DC具有不同亚型。脾脏中的两种主要的DC亚型是：CD8+DEC205+，另一种为CD8-33D1+。它们位于脾脏的不同解剖位置：前者位于T细胞区，后者位于红髓与边缘区。这两种亚型可能依据表面分子标志进一步细分（图1A，C与S1）
CD8+DEC205+DC似乎能特异地摄取死亡细胞，并能独立地对抗某些病毒感染。两种DC亚型其它方面显著的区别是CD8+DEC205+ DC可以特异地抗原交叉提呈，即加工非复制型抗原并经MHC I分子提呈给T细胞的能力。然而，还没有体内两个DC亚型加工抗原异同的研究。
通过将基因芯片与侯选基因的结合，我们鉴定出33D1 mAb识别的抗原，并且发现它是DC抑制性受体2（DCIR-2）(图1D/E/S2)。DC表达高水平的凝集素、DCIR2及DEC205，除此外，CD8+DEC205+DC与CD8-33D1+DC在表达其它的一些凝集素方面很不相同（图1D，S2B）。为评估体内这两种DC细胞对抗原加工及T细胞活化的调节功能，我们将嵌合的αDEC205与33D1抗体原位给予这两群DC。注射的抗体给予DCOVA抗原的给予丰DC被纯化 体外抗原提呈给对OVA肽特异转基因的OT-1或OT-II T细胞（分别由MHC-I或MHC-II提呈）。如前报道，体内以αDEC205抗体-OVA抗原嵌合体刺激的DC诱导了OT-I与OT-II T细胞的体外增殖，尽管OT-II的增殖程度相对较弱（图1F）。相反地，以33D1抗体-OVA处理的DC有刺激OT-II T细胞高水平增殖，而OT-I T细胞的反应检测不出（图1F）。从注射了αDEC205-OVA或33D1-OVA小鼠的B细胞与其它非DC细胞不能提呈OVA给OT-1或OT-IIT细胞，而不表现出增殖。这种嵌合的抗体抗原体内注射后，检测到DEC205在CD8+DEC205+DCs及33D1在CD8-33D1+DC的定位，明确地阐明了这种靶抗原的特异性。虽然DEC205结合内化抗原的速度与量较33D1高，这两种抗体均不影响DC的成熟状态，成熟状态是以表面标志如MHCII/CD80/86/69/40表达水平确定的。最后，因为当将抗原肽处理后加到体外培养体系中时，两种DC亚型将抗原提呈给相同的转基因鼠T细胞的能力是相当的，因而认为体内两种DC亚型提呈能力的不同不是由于它们处理抗原的不同。（图S6）。结论认为体内DC加工DEC205-OVA或 33D1-OVA两种靶抗原是不同的，但在体外依赖MHC-I或MHC-II提呈时是不同的。
图１：体外CD4/CD8 T细胞对靶抗原的反应。
Ａ免疫组化法检测33D1（绿色）/DEC205(红)/B220(蓝)于脾脏分布。说明：DEC205位于白髓的中间T细胞区；而其外周的边缘区及红髓区为33D1区染色阳性且为B细胞区。
B图为流式术检测所有脾细胞表达CD11c与DEC205分布的散点图，C图为B图中CD11c高表达的一群细设门，观察33D1与DEC205阳性的两群细胞设门。说明：脾脏CD11c+DC主要分为CD8-33D1（69%）与CD8+DEC205（15.4%）两群。
D图 方法：从野株小鼠（WT-，以-标记）及Flt3L-黑素瘤注射的小鼠（+标记）采用FACS分选出CD8+DEC205+, CD8-33D1+，以及野株鼠中分选出B细胞/CD4+或CD8+ T细胞，再分别提取这些细胞的总RNA。每一根柱子代表三个个体基因点阵的均数。Affymetrix(公司名称)基因点阵技术分析候选C型凝集素基因。说明：①B、T细胞上右侧所列出的基因无差异，差异见于两群DC；而且两群DC细胞表达这些基因的差异与DC的来源（野株或转基因瘤注射鼠？）不明显；②这些有差异的基因主要位于DCIR1/DCIR6的RNA等右侧上面四行。
E图 方法：为短暂转染指定cDNAs的293T细胞，分别以33D1-A647（黑）与同型对照IgG2b-A647抗体（灰）标记进行流式检测，以直方图表示，发现DCIR2表达明显增高。说明：的染色
F图 方法：为显示从10ug 33D1 OVA，DEC-OAVA， ISO-OVA 注射给C57BL/6小鼠，12小时后分离出DC/B/非B非DC细胞，将这些细胞与OT-I与OT-II T细胞体外共培养，检测3H 胸腺嘧啶吸收率以了解T细胞增殖情况。表明：体内以αDEC205抗体-OVA抗原嵌合体刺激的DC诱导了OT-I与OT-II T细胞的体外增殖，尽管OT-II的增殖程度相对较弱。相反地，以33D1抗体-OVA处理的DC有刺激OT-II T细胞高水平增殖，而OT-I T细胞的反应检测不出。从注射了αDEC205-OVA或33D1-OVA小鼠的B细胞与其它非DC细胞不能提呈OVA给OT-1或OT-IIT细胞，而不表现出增殖。
G图 方法:为静脉注射10ug DEC205-OVA,33D1-OVA或Iso-OVA对照，30分钟后流式检测。结果发现DEC205或33D1抗体分别与CD8+DEC205+及CD8-33D1+DCs上的相应细胞表面分子结合。说明：嵌合抗体抗原分别定位于两种DC细胞上表明靶抗原作用的特异性。
H图 方法：为分选DC（没有必要将两种DC分开）后，体外给予上述两种抗体抗原嵌合体，0度（灰色）或37度（黑色）孵育，孵育时间分别为0/30/60分钟，流式检测。对CD11c+CD8-与CD11c+CD8+DCs设门。表明：其抗原内化的速度与总量的差异，即DEC205结合内化抗原的速度与量较33D1高。
为检测体内T细胞对提呈抗原的反应性，我们用CFSE，一种显示细胞分裂的染料，染色OT-1与OT-II T细胞，T细胞过继转输后检测其增殖情况。如体外研究结果一致，我们发现DEC205-OVA 诱导的MHC I 限制的OT-1 T细胞发生最大反应，而33D1-OVA主要诱导 MHCII限制的OT II T细胞反应。通过体内剂量反应实验，比较T细胞分裂与转输后T细胞的扩增情况，发现33D1-OVA将抗原提呈给OT-II T细胞的能力为DEC-205-OVA的10倍，提呈给OT-I T细胞的能力只有DEC205-OVA的1/10。单次给予DEC205抗体-OVA或33D1抗体-OVA注射后，抗原提呈持续时间较长。这样， DEC205-OVA注射10天后，才将OT-1 T细胞过继转输给新宿主，OT-1细胞仍然增殖；同样地，33D1-OVA注射5天后，再过继转输OT-II T细胞，仍能增殖（图2C）。然而，静息状态下T细胞对抗原的增殖反应迅速消失，剩余的细胞对于体外进一步刺激亦无反应（图2D、E）。相对的，当33D1抗体嵌合抗原与α(应该为anti)CD40活化的DC共同作用于T细胞时，T细胞的扩增则可维持并在体外对抗原再刺激显示强烈反应（图2F，G）。因此，体内将抗原给予CD8-33D1+ DC将导致 MHC-II 限制的抗原提呈。不仅如此，抗原给予静息的两种DC亚型后导致T细胞耐受，而给予CD40L活化的DC后导致了T细胞的扩增，并保持对抗原的反应性。
图2 体内CD4 与CD8 T细胞对靶抗原的反应
A图 方法：CFSE标记OT-I （左侧）或OT-II（右侧）T细胞，将不同剂量的33D1-OVA， αDEC-OVA或对照抗体注射小鼠3天后，流式分析上述细胞增殖情况。结果：直方图显示300ng的抗体抗原嵌合体诱导两种T细胞增殖能力最强。
B图 方法：300ng 33D1-OVA，αDEC-OVA或对照抗体注射小鼠3天后，流式术检测鼠脾脏中OT-I 或OT-II T细胞相对数量。结果：Vα2+CD45.2+ 的CD4 或CD8 T细胞（以Vα2+CD45.2+同时圈选CD4CD8阳性细胞）设门，散点图示
C图 方法：如A，以3ug的相应抗体注射给小鼠，于1，3，5，10，20天后转输T细胞，3天后流式检测T细胞增殖情况。结果：5天、10天后残留的抗体仍刺激T细胞增殖。
D图 方法：如B，嵌合抗体抗原注射9天后，流式术检测鼠脾脏中OT-I 或OT-II T细胞相对数量。结果：Vα2+CD45.2+ 的CD4 或CD8 T细胞（以Vα2+CD45.2+同时圈选CD4CD8阳性细胞）设门，散点图示
E图 方法：3ug 33D1-OVA，αDEC-OVA或对照抗体注射小鼠9天后，分选CD4 或CD8阳性T细胞，再体外给予抗原刺激，3H吸收值观察T细胞增殖情况。结果：
F图 方法：如D，以50ug αCD40抗体与靶抗体一起注射，诱导 DC的成熟。结果：T细胞增殖均不明显。
G图 方法：如E，不同的是以50ug αCD40抗体与靶抗体一起注射，诱导 DC的成熟。结果：DEC-OVA诱导OT-1显著增殖，而33D1-OVA诱导OT-II显著增殖。与E图比较，50ug的抗 CD40激活的DC较低剂量的抗 CD40激活的DC情况下，33D1-OVA诱导OT-II T细胞增殖能力增高。
为研究这两种DC提呈分化抗原的机制，我们使用MHC II-HEL（hen egg lysozyme鸡卵溶菌酶, HEL）复合物抗体，来观察其形成过程。注射抗DEC205-HEL复合物抗体3小时后，CD8+DEC205+ DC表面出现小量MHC II-P，持续时间不到1 天（图3A）。而33D1-HEL复合物抗体作用CD8-33D1+ DC 3小时后，细胞表面出现大量MHC II-P复合物并能持续2天之久。MHC-P复合物形成对于靶抗体具有特异性，并且不依赖DC的活化，这是因为缺乏LPS-TLR4的小鼠与野株小鼠相比无差异（图3A、B）。我们认为33D1抗体传递的抗原给处于静息状态的CD8-33D1 DC，被加工并以MHC II-P形式迁移到细胞表面的效率较DEC205 迁移到CD8+DEC 205+DC的效率更高。
为确定所观察到的抗原加工的不同，是由于这两种DC亚型的内在不同，而非两种DC表面分子的不同，我们又制备转基因小鼠模型，使其体内两种DC亚型均同等水平地表达人DEC205 （CD11c-hDEC205 B10.BR 转基因鼠），并且用抗hDEC205抗体（与小鼠DEC205无交叉反应）注射给转基因鼠而非野株鼠以实施针对性实验（图S7，注意CD11c-hDEC205在小鼠两种DC上显示的效果相当），然后检测细胞表面IgG的抗体（荧光流式抗体的抗原是上述复合物抗体），发现转基因而非野株小鼠体内两种DC特异地被hDEC205-HEL打靶（图S8）。然而，仅CD8- 33D1+ CD11C-hDEC205转基因小鼠注射hDEC205-OVA或hDEC205-HEL后，DC表面显示高水平的MHC-P（图3C，S9）。
为进一步比较DEC205抗体-OVA抗原与33D1抗体-OVA抗原在同一细胞的打靶提呈，我们将编码DCIR2与GFP的逆转录病毒感染骨髓源、DCIR2缺陷DC。通过GFP分选表达逆转录病毒编码的DCIR2的感染DC，再用DEC205-OVA或33D1-OVA嵌合体体外打靶。LPS刺激DC成熟后，抗原提呈给OT-II T细胞的能力在两种嵌合体的作用下是相当的（图S10B）。这表明成熟的骨髓源DCs（BMDCs）提呈MHC II抗原，这个过程并不依赖DEC205-OVA抑或33D1-OVA的打靶。我们认为DC亚型处理MHC-II的不同是细胞内在的不同，而与DEC205或33D1抗体的靶抗原（即细胞表面分子）无关。
图3 体内两种DC亚型表面形成MHC II-P复合物的过程
图A 方法：野株鼠B10.BR静脉注射10ug αDEC205-HEL或33D1-HEL 复合物抗体或iso-HEL对照，30分钟、3小时、1天或2天后分别流式检测CD8+DEC205+ 与CD8-33D1+ DC表面MHCII-HEL形成的量；结果：而33D1-HEL复合物抗体作用CD8-33D1+ DC 3小时后，细胞表面出现大量MHC II-P复合物并能持续2天之久；注射抗DEC205-HEL复合物抗体3小时后，CD8+DEC205+ DC表面出现小量MHC II-P，持续时间不到1 天。
B图 方法：上述实验在一种LPS-TLR4缺陷小鼠体内进行。结果：与图A完全一致。
C图 方法：30ug αhDEC205-HEL 静脉注射给CD11c-hDEC205转基因鼠（hDEC+）或对照的同窝鼠（C57BL/6×B10.BR，简称为hDEC-），30分钟、3小时、1天后流式术检测CDEC205与CD8-33D1+ DC表面MHCII-P的水平（检测细胞表面IgG抗体）。结果：仅CD8- 33D1+ CD11C-hDEC205转基因小鼠注射hDEC205-OVA或hDEC205-HEL复合物抗体后，DC表面显示高水平的MHC-P。
由两群DC表达的、调节MHC I与MHC II分子加工抗原的途径的蛋白分子，在此前已多有阐述。为明确这两种DC亚型存在系统上的区别，表达MHC I与MHC II分子加工抗原过程中成分的不同，我们提取这两种DC亚型的总RNA进行基因芯片分析。发现两DC亚型分化上表达MHC I与MHC II分子加工抗原相关的蛋白与其产生MHC II-P的能力及诱导CD4与CD8 T细胞反应相一致。CD8+DEC205 DC，倾向于提呈MHC I分子抗原，在表达Tap1,Tap2,calreticulin, Calnexin, Sec61,ERp57,ERAAP, cystatin B/C, 这些孝参与到MHC I 抗原提呈或抑制MHCII-肽提呈的酶活性。对应地，CD8-33D1+DC，主要提呈MHC II分子，富含cathepsins C/H/Z, asparagines endopeptidase (AEP), GILT与H2-Mbeta I，这些分子都参与到MHC II抗原加工提呈过程中。为证实这些蛋白分子表达于不同的DC亚型，我们采用FACS分选DC再分析胞内H2DM，Western Blotting 实验。MHC I 分子加工相关蛋白在CD8+DEC205+ DC上高表达，而MCH II分子加工抗原相关蛋白在CDC8-33D1+DC上高表达。我们认为这些差异与这两群细胞加工、提呈抗原过程相关。
图4：MHC I 分子- MHC II 分子相关蛋白表达的差异。
A、B图 方法：从野株（-）与Flt3L-骨髓瘤注射的小鼠（+）分选出CD8+DEC205 DC 与CD8-33D1+ DC，提取mRNA，上基因芯片，分析MHCII（A图）或MHC I（B图）相关抗原加工过程蛋白基因的表达；每个柱子代表三个不同个体基因的均值。结果：
C图 方法：胞内FACS分析CD8+DEC205 DC 与CD8-33D1+ DC内H2-DMb1/H2-DMa异源二聚体。结果：
D图 方法：从脾脏CD8+DEC205 DC 与CD8-33D1+ DC的提取蛋白中，Western Blot分析cathepsin H, Gilt, AEP。结果：
E图 方法：从脾脏CD8+DEC205 DC 与CD8-33D1+ DC的提取蛋白中，Western Blot分析Tap-1, tapasin, cystatin C, calnexin 与Calreticulin. Lysosomal 标志LAMP-1（溶酶体相关膜蛋白1）结果：
F图 方法：Western blot 显示上样中β-actin
抗原被DC有效地提呈需要对溶酶体蛋白的降解进行调节。然而，MHC II分子的提呈及MHCI 的交叉提呈是不同的，因为MHCII分子加工过程发生于溶酶体，而MHCI的交叉提呈要求抗原离开溶酶体到达胞浆，以结合蛋白酶体proteasome及TAP转运子。体外研究发现DC的调控十分精细，在DC发育过程， 通过控制溶酶体加工及MHCII向胞膜转运，以调节抗原提呈。培养的未成熟DC捕获抗原，但仅加工之，当暴露于炎症刺激或TLR配体才提呈给MHCII分了。这种独特地区别抗原的能力对于DC从炎症部位向淋巴器官转移是十分重要，并且有助于抗原离开溶酶体到达胞浆或内质网而进行抗原交叉提呈。然而，DC不能降解抗原可能也是一个MHCII-p的亚适度的发生器suboptimal producers。我们的实验表明在一个完整的宿主内，这个问题通过产生一些DC亚群而获得解决，这些DC亚群特异地最大化地提呈MHCII抗原。尽管CD8+DEC205+ DC 通过提呈MHCII而启动免疫反应，CD8-33D1+ DC 更能产生MHCII-p。这种特异性可能对于理解体内T细胞初始反应与疫苗设计十分重要。
很好，希望以后多发点类似的文章。
